Regulación de la expresión de antioxidantes y hemoglobinas de lotus japonicus en respuesta a estrés y hormonas

Resumen

Agronómicamente, las leguminosas son el segundo grupo de plantas más importantes después de los cereales, ya que son una importante fuente de alimentación humana y animal. Además, a nivel medio ambiental establecen simbiosis con unas bacterias del suelo denominadas rizobios, formándose un nuevo órgano en la raíz de la planta, el nódulo, en donde tiene lugar la fijación biológica de nitrógeno. Mediante este proceso, las leguminosas son capaces de fijar el nitrógeno atmosférico, permitiendo a esta familia de plantas crecer en suelos pobres en nutrientes, así como, contribuir a la disminución del uso de fertilizantes nitrogenados en la agricultura, compuestos muy contaminantes cuya producción implica, además, elevados costes económicos y energéticos. Para la fijación biológica de nitrógeno, el enzima clave es el complejo nitrogenasa, cuya actividad es inhibida por el O2. Por otro lado, el O2 es necesario para poder cubrir la demanda energética de la célula durante el proceso de fijación biológica de nitrógeno. Debido a esto, la concentración de O2 en el nódulo está regulada, entre otros mecanismos, por la leghemoglobina. La leghemoglobina es una proteína globular que contiene un grupo hemo. En plantas fue la primera hemoglobina descubierta. Actualmente, además de las hemoglobinas simbióticas y la leghemoglobina (exclusiva de nódulos) que participan en el proceso de fijación biológica de nitrógeno, se han descrito otro tipo de hemoglobinas: hemoglobinas no simbióticas (divididas a su vez en hemoglobinas de clase 1 y clase 2) y hemoglobinas truncadas. La fijación biológica de nitrógeno y cualquier proceso fisiológico de la planta puede verse alterado por los factores ambientales, que pueden originar una situación de estrés y limitar la productividad de los cultivos. Agronómicamente, uno de los problemas ambientales más importantes actualmente es la salinización de los suelos. Se ha comprobado que la salinidad, así como otros tipos de estreses, induce la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y de nitrógeno (RNS) en las células. En condiciones normales, los niveles de ROS y RNS están controlados por los sistemas antioxidantes de las células. Pero en situaciones de estrés, los niveles de ROS y RNS pueden elevarse por enzima de concentraciones fisiológicas originando un estrés oxidativo y/o nitrosativo, que puede dar lugar a la muerte de la célula. Los sistemas antioxidantes de las células incluyen sistemas enzimáticos y no enzimáticos. De entre los sistemas no enzimáticos podemos destacar el glutatión (GSH), que es el tripéptido tiólico más abundante en plantas. En leguminosas, además de GSH o en sustitución de este puede sintetizarse homoglutatión (hGHS). Todos los experimentos realizados en esta Tesis se hicieron en la leguminosas modelo Lotus japonicus. Los objetivos planteados fueron: 1. Estudio fisiológico, bioquímico y molecular de la respuesta antioxidante de Lotus japonicus al estrés salino. 2. Determinación de los mecanismos de regulación de la ruta de biosíntesis de tioles en Lotus japonicus en respuesta a óxido nítrico y hormonas. 3. Caracterización estructural y funcional de los genes de las hemoglobinas no simbióticas de Lotus japonicus. Este estudio incluye el análisis de la expresión génica en respuesta a óxido nítrico, estrés abiótico y hormonas, así como la localización de los transcritos y de la actividad de los promotores en los nódulos. Los resultados obtenidos, nos han permitido concluir que: 1. La leguminosa modelo Lotus japonicus es más tolerante a la salinidad (NaCl 150 mM durante 7 días) que algunas leguminosas de interés agronómico como la judía o el guisante, a juzgar por diversos marcadores fisiológicos y bioquímicos. En el tratamiento salino más intenso (NaCl 50 150 mM durante 18 días), la respuesta antioxidante de la planta es sobrepasada, generándose un estrés oxidativo. La diferente respuesta a los dos estreses salinos es atribuible a la duración de los tratamientos más que a las concentraciones de NaCl aplicadas. 2. Los genes glutatión sintetasa y homoglutatión sintetasa de L. japonicus muestran una regulación diferencial en respuesta a moléculas señal como el óxido nítrico y hormonas, y también se expresan de manera diferente en hojas, raíces y nódulos, lo que apoya una distinta función del glutatión y homoglutatión en el desarrollo de la planta. En las raíces, el homoglutatión es el tiol más abundante y su síntesis está regulada post traduccionalmente. 3. Además de tres genes de leghemoglobinas, en el genoma de L. japonicus existen cinco genes que codifican dos hemoglobinas no simbioticas de clase 1 (LjGLB1-1 y LjGLB1-2), una hemoglobina no simbiótica de clase 2 (LjGLB2) y dos hemoglobinas truncadas (LjGLB3-1 y LjGLB3-2). Estos genes se expresan de manera diferencial en los órganos vegetales y en respuesta a óxido nítrico, estrés abiótico y hormonas. Así, el gen LjGLB1-1 se induce por óxido nítrico, hipoxia y bajas temperaturas en las raíces, mientras que las citokininas causan una completa inactivación de LjGLB2 y LjGLB3-1 en los nódulos y la inducción de LjGLB1-1 en las raíces. Los transcritos de las hemoglobinas LjGLB1-1, LjGLB2 y LjGLB3-1 son muy abundantes en los nódulos y se localizan preferentemente en el córtex, en los haces vasculares y, según el estado de desarrollo de los nódulos, también en la zona infectada. Los elevados niveles de expresión de estas hemoglobinas en los nódulos, su localización en los tejidos de nódulos y raíces con alta actividad metabólica y sus distintos mecanismos de regulación nos llevan a proponer que las tres clases de hemoglobinas son esenciales para la simbiosis y desempeñan funciones complementarias.