Caracterización de los efectos antioxidantes y proliferativos del ácido maslínico en diferentes líneas tumorales

Laburpena

El ácido maslínico es un triterpeno pentacíclico presente en la capa cerosa que recubre el fruto y la hoja del olivo, perteneciente al grupo de los oleanano triterpenoides. Este compuesto ha mostrado de forma preliminar propiedades anticancerígenas, antiinflamatorias, antioxidantes, activadoras del sistema inmune, antivirales, entre otras. Las propiedades antioxidantes del ácido maslínico han sido poco estudiadas, por lo cual, en este trabajo se resalta la necesidad de determinar la capacidad antioxidante de dicho compuesto en situaciones de estrés oxidativo sobre líneas celulares cultivadas in vitro, previamente tratadas con tres condiciones estresantes (privación de suero, presencia de peróxido de hidrógeno y nitroprusiato sódico). Para llevar a cabo dicho estudio se realizaron diferentes ensayos utilizando líneas celulares de melanoma murino (B16-F10) y células normales de músculo liso (A10). Estos ensayos consistieron, en primer lugar, de estudios de viabilidad celular mediante incorporación de MTT en la determinación de la concentración IC50 en ambas líneas celulares. Los tratamientos siguientes fueron realizados con concentraciones inferiores a dicho IC50. Posteriormente, fue determinada la actividad celular mediante citometría de flujo por uso de 1, 2, 3-dihidrorodamina y finalmente, se analizaron los niveles de expresión y de actividad de las enzimas relacionadas con la defensa antioxidante. Los resultados permitieron determinar que el ácido maslínico es efectivo en la protección contra el daño oxidativo celular causado a nuestras células. Este hecho demostró en las condiciones experimentales, el AM tiene un claro efecto sobre la actividad de estas enzimas, modificando la actividad de las mismas; y, por otro lado, también es capaz de inducir la mayor o menor expresión de estas enzimas, dependiendo del estado de estrés y dependiendo de la dosis del mismo y del tipo celular, ya que este efecto protector es mayor en las células normales estresadas, que las tumorales. Teniendo en cuenta que estos compuestos pueden también afectar significativamente los procesos de crecimiento en condiciones normales, se decidió estudiar los aspectos moleculares relacionados con los posibles efectos proliferativos junto con su efecto protector apoptótico provocado por el estrés oxidativo ocasionado por la privación del suero en líneas celulares de origen humano cultivadas in vitro, ya que este efecto fue observado previamente en peces. Para llevar a cabo dicho estudio se han realizado diferentes ensayos utilizando como modelo las líneas celulares de carcinoma humano HT29 (carcinoma de colon) y HepG2 (hepatoma). Para corroborar y comprobar si realmente el ácido maslínico inducía un efecto proliferativo sobre células en cultivo, se estudió la acción de dicho compuesto sobre el ciclo celular por citometría de flujo y la actividad enzimática de la defensa antioxidante. Para continuar caracterizando este efecto y corroborar los resultados anteriores, se analizaron los niveles de expresión de las proteínas p-IkB y p-Akt, ambas implicadas en procesos de proliferación. Para ello, se determinó la concentración de proteínas por el método BCA. Los resultados mostraron una mayor cantidad de proteína a las concentraciones de IC50/4 e IC50/8, con respecto al control negativo tanto en el caso de HepG2, como en el caso de HT29. Resultados que concuerdan con los obtenidos en el contaje celular. Los ensayos de expresión por western-blot de los niveles de proteínas p-Akt y p-IkB mostraron una disminución dosis dependiente de la expresión de estas proteínas, así cuanto mayor es la concentración del ácido maslínico, menor es la expresión de las proteínas, estos resultados podrían explicar el efecto proliferativo del compuesto observado a bajas dosis. Para profundizar sobre el mecanismo de acción de MA como agente antitumoral, hemos investigado sus efectos sobre el citoesqueleto. Se utilizó un procedimiento de proteómica basado en la electroforesis bidimensional en gel, análisis de masas et huellas dactilares de masa péptica. La incubación de las células HT29 con MA llevó a un arresto de la fase G1 del ciclo celular. Después de 24 horas de exposición a 3,7 ¿M (IC50/8) y 30 ¿M de MA (IC50) catorce proteínas del citoesqueleto diferencialmente expresadas podrían ser reconocidas. Un grupo de estas proteínas, compuesto de queratina 2, queratina 8, queratina tipo II citoesqueletal 8, queratina tipo I citoesqueletal 9, queratina tipo I citoesqueletal 18, citoqueratinas 18 y 19, y ß-actina, ejercen una función estructural, mientras que otro grupo, compuesto de lamina B1, gelsolina 1, septina 2, villina 1, proteína 2 relacionada con actina y moesina, está relacionada con la nucleación de la actina y la formación de citoesqueleto. Los cambios en la expresión de moesina, villina 1 y ß-actina identificados por las técnicas de proteómica fueron corroborados por Western Blot. Esta es la primera evidencia obtenida de los efectos reguladores de MA en el citoesqueleto, que puede llegar a ser una de las bases de su efecto anti-proliferativo contra las células de cáncer de colon.