Fenilalanina amonio-liasa y polifenol oxidasa de olivo(olea europaea l.) cv picual y su relación con la concentración de fenoles durante la maduración del fruto en diferentes variedades y en respuesta al estrés por frío

Resumen

Se ha determinado el comportamiento cinético, niveles de expresión proteica y localización tisular de la fenilalanina amonio-liasa (PAL) y polifenol oxidasa (PPO) y su relación con la concentración de fenoles totales, oleuropeína, hidroxitirosol y tirosol en olivos (Olea europaea L.) de cultivares de la variedad Picual. Se han llevado a cabo técnicas de extracción y purificación, técnicas espectrofotométricas, electroforesis en gel de poliacrilamida, en condiciones parcialmente o totalmente desnaturalizantes, "Western-blot", inmunohistoquímica a microscopía óptica y HPLC-UV/Vis y HPLC-MS-MS. PAL de hoja y fruto muestra una cinética hiperbólica, con una Km de 0,2 mM y una masa molecular aparente de 75 kDa. Se ha localizado en células de la epidermis y del parénquima y puede estar asociada, en hojas, a procesos de defensa y, en fruto, a la síntesis de antocianinas y otros fenoles. PPO está presente también en hoja y en fruto, aunque su actividad y niveles son significativamente mayores en fruto. Presenta una cinética hiperbólica con una Km frente al catecol de 8 mM. Se ha determinado el grado de especificidad de PPO por otros substratos y se ha observado diferencias significativas en el comportamiento cinético en hoja y en fruto. Esto, junto con el patrón diferencial de bandas encontrado mediante PAGE en condiciones particialmente desnaturalizantes, a lo largo de la maduración, hace suponer que se trate de isoenzimas diferentes los que se expresan en ambos órganos. En el fruto, PPO es una proteína que presenta una masa molecular aparente de 55 kDa en condiciones parcialmente desnaturalizantes y 28 kDa en condiciones totalmente desnaturalizantes. En fruto se ha localizado en la epidermis y, en hoja, además de en la epidermis, en el parénquima y en las células acompañantes del fluoema. En epidermis y parénquima parece que se encuentra asociada a los plastos. La oleuropeína es el compuesto fenólico que muestra una mayor concentración en extractos de fruto y hoja. En un segundo experimento se ha determinado el comportamiento cinético y niveles de expresión de PAL y PPO durante la maduración del fruto. En fruto y en hoja, PAL cambia como en dos ciclos, uno antes y otro después del envero indicando que la síntesis de fenoles puede darse en dos fases, asociada en el fruto, a la síntesis de antocianinas que producen la pigmentación de la aceituna. PPO incrementa a medida que transcurre la maduración apareciendo una nueva banda de 36 kDa en las últimas etapas que puede servir de marcador de que el proceso se está completando. Al mismo tiempo se produce un significativo descenso en la concentración de fenoles totales, oleuropeína, tirosol e hidroxitirosol que parece que no está asociado al aumento en la actividad PPO. En un tercer experimento realizado en las variedades Picual, Verdial, Arbequina y Frantoio a lo largo de la maduración del fruto se ha observado que existe una respuesta gradual y coordinada entre PAL y PPO que puede determinar la concentración final de fenoles totales en estas variedades. Frantoio es la variedad que muestra unos niveles de fenoles totales más altos y la que presenta unos valores más altos de actividad PAL y los más bajos de actividad PPO. Verdial es la que muestra unos niveles de fenoles totales más bajos, menor activdad PAL y mayor actividad PPO. Picual y Arbequina muestran valores intermedios de actividad PAL y PPO coincidiendo con una concentración de fenoles totales intermedia. Los perfiles cromatográficos de la fracción fenólica de los frutos de las cuatro variedades así como su evolución a lo largo de la maduración pueden servir para la caracterización y diferenciación bioquímica de cada variedad. En un cuarto experimento se ha observado que en hoja de olivos de la variedad Picual sometidos a diferentes niveles de afectación por frío y heladas, se producen la estimulación diferencial de la actividad PAL y PPO así como un fuerte incremento en la concentración de oleuropeína. Estos resultados desmuestran que PAL, PPO y oleuropeína son tres elementos implicados en la respuesta del olivo ante el estrés por frío y que podrían formar parte de un mecanismo de resistencia ante esta situación.