Estudio de la deleción espontánea de los exones 45–55 en el gen DMD y su aplicación como modelo de terapia génica. Análisis de factores condicionantes del fenotipo y estudio del modelo celular

Resumen

La deleción de los exones 45 al 55 en el gen DMD (del45-55) se ha postulado como un interesante modelo terapéutico, mediante el que se podrían beneficiar hasta 60% de pacientes con distrofia muscular de Duchenne. Sin embargo, ésta se expresa con una gran variabilidad clínica, observando sujetos asintomáticos, mientras que otros presentan debilidad muscular, así como alteraciones cardiacas severas. El objetivo de la presente tesis doctoral es llevar a cabo un profundo análisis de la del45-55 para tratar de desvelar los factores que promueven su presentación de manera asintomática, de forma que pueda replicarse como modelo de terapia para la distrofia muscular de Duchenne. Metodología Para ello, se coordinó un estudio transversal multicéntrico, para identificar al máximo y realizar una evaluación clínica y funcional de sujetos con la del45-55. Además, se diseñó un panel de genes de secuenciación masiva para analizar los casos índice y determinar los puntos de rotura en los intrones 44 y 55 del gen DMD; así como la presencia de polimorfismos en genes modificadores de DMD y de mutaciones concurrentes. Se llevó a cabo análisis de estadística bayesiana estudios de correlación. También se realizó estudios de haplotipos, así como de expresión de distrofina en nueve biopsias musculares. Como prueba de concepto se procedió a reproducir del45-55 específica encontrada en un subgrupo de sujetos analizados; en una línea de mioblastos DMD, mediante el sistema de edición CRISPR-Cas9. Resultados La serie recogida consta de un total de 57 sujetos, 23 índice que expresan fenotipo tipo Becker (28%), cardiopatía aislada (19%) y signos asintomáticos (53%). Se detectaron alteraciones cognitivas en el 90% de los pacientes pediátricos. Los casos índice se agruparon en únicamente 10 deleciones con puntos de rotura específicos, debido 5 eventos fundadores (uno recurrente). El subgrupo D5 se asoció estadísticamente con una mayor severidad, no encontrando alteraciones promovidas por sus puntos de rotura. Todas las biopsias analizadas presentaban una expresión de distrofina superior al 67%. Entre los factores modificadores en trans explorados, encontramos que la ausencia de un determinado haplotipo en LTBP4 se asociaba con la presencia de cardiopatía. La introducción de la del45-55 en mioblastos DMD mediante CRIPSR-Cas9 es capaz de recuperar la expresión de distrofina y mejorar los defectos de diferenciación que presentaba esta línea, sin ocasionar modificaciones no deseadas en el genoma. Conclusión Se confirmó que la del45-55 segrega con una gran proporción de fenotipos asintomáticos o benignos, pero también existe la presencia de formas severas, de cardiopatía aislada y alteraciones cognitivas. Aunque identificamos una influencia de un determinado punto de rotura y del haplotipo en LTBP4 con la severidad, deben existir otros mecanismos responsables de la variabilidad. Aún así la del45-55 podría suponer un potencial modelo terapéutico para DMD.