Diseño, síntesis y fotofísica de nuevos sensores fluorescentes aplicables a la detección de eventos biológicos en células vivas y tejidos

Resum

Multitud de enfermedades de diversa etiología son producidas por anomalías en el metabolismo del sistema enzimático. Por lo tanto, la detección de la actividad de ciertas enzimas proporciona información útil para el diagnóstico, el pronóstico, o la evaluación de la respuesta a la terapia. Entre las diferentes enzimas utilizadas como marcadores, existen tres que ocupan unas posiciones relevantes dadas sus implicaciones en la salud: la alanina aminopeptidasa (pepN), la dipeptidilpeptidasa IV (DPP IV) y la tirosinasa (TYR). Así, la pepN es una proteasa implicada en varios procesos patológicos, entre los que se encuentra la supervivencia, el crecimiento y el desarrollo de microorganismos, en concreto las bacterias gramnegativas o Gram (-). Por su parte, la DPP IV es una glicoproteína transmembrana encontrada en la circulación sanguínea, la cual juega un papel clave en procesos como el metabolismo de la glucosa y la estimulación de las células T. Adicionalmente, se encuentra sobreexpresada en cáncer de colon, riñón, próstata y tiroides, y puede servir incluso como marcador de diagnóstico en pacientes con enfermedades de depósito lisosomal. Finalmente, la TYR es una enzima cuya expresión o activación anómala está asociada con enfermedades como el melanoma o el Parkinson. Por todo ello, la detección de las mismas suscita un gran interés en la comunidad científica dado que, además de permitir el diagnóstico y seguimiento de la enfermedad en la que estén implicadas, pueden convertirse en dianas muy atractivas para la terapia farmacológica. Entre los distintos ensayos de actividad enzimática, las técnicas fluorimétricas, y más concretamente, la microscopía de imagen de fluorescencia, son de gran interés dada su alta sensibilidad y su carácter no invasivo. Adicionalmente, la microscopía de fluorescencia con excitación por dos fotones (Two-photon microscopy, TPM) de longitud de onda cercana al infrarrojo (por sus siglas en inglés, NIR) permite lograr imágenes a mayor profundidad del interior del organismo estudiado, mientras que la microscopía de fluorescencia de superresolución (entre las distintas existentes, el método STED, Stimulated Emission Depletion) consigue, como su nombre indica, la adquisición de imágenes con una mejoría asociada en su resolución. Por ello, la síntesis y aplicación de nuevas sondas fluorescentes NIR, excitables por dos fotones y útiles para microscopía de superresolución adquiere un gran interés en el análisis biológico. Como consecuencia de la anterior introducción, se ha planteado la presente Tesis Doctoral con los objetivos de sintetizar, caracterizar fotofísicamente y aplicar al estudio de células, tejidos y organismos vivos, tres nuevos sensores fluorescentes que sean específicos para cada una de las tres enzimas citadas y que cumplan los requisitos mencionados con anterioridad. Para ello, partiendo del derivado del dicianometileno-4H-pirano (DCM-NH2), bien conocido como sensor NIR en el que existe una transferencia de carga intramolecular (por sus siglas en inglés, ICT), se han obtenido los sensores DCM-NH-Ala, DCM-NH-Pro-Gly y DCM-HBU, mediante el acoplamiento de un residuo alanina, un dipéptido de prolina-glicina, y un grupo 4-hidroxibencilamina, respectivamente, como grupos sensibles a la actuación de pepN, DPP IV y TYR. La adición de los grupos mencionados extingue (quenchea) la fluorescencia NIR del fluoróforo DCM-NH2 debido al fuerte efecto como aceptor electrónico del enlace amida. Posteriormente cuando actúe la enzima en cuestión, se libera el DCM-NH2 restaurándose la transferencia de carga intramolecular y emitiendo una intensa señal fluorescente con máximo sobre los 660 nm. Debido a que las señales fluorescentes de los sensores se presentan en el intervalo entre 500 y 550 nm, que es el intervalo de longitudes de onda donde muestra una débil señal el compuesto DCM-NH- unido a los distintos aceptores electrónicos, los sensores sintetizados se pueden considerar como sondas ratiométricas, lo que supone una ventaja adicional en la detección, ya que permite el cálculo de la actividad enzimática a través de la relación entre la señal alrededor de 660 nm (correspondiente al DCM-NH2 que se genera cuando la enzima rompe el enlace amida) y la señal en el intervalo 500-550 nm. Con la síntesis y aplicación del sensor DCM-NH-Ala se ha propuesto una nueva metodología para la identificación de bacterias gramnegativas que expresan pepN. Así, la hidrólisis de este sustrato por pepN produce un fuerte aumento de la banda de fluorescencia con pico a 662 nm cuando es excitada por un único fotón de 480 nm o por dos fotones NIR (de aproximadamente 800 nm). La velocidad de aumento de la señal de emisión depende de las concentraciones intracelulares de pepN, lo que proporciona una potente herramienta para detectar diversas bacterias virulentas en pocos minutos y con las ventajas inherentes a la excitación bifotónica. Se ha resuelto la cinética enzimática, obteniéndose los parámetros de Michaelis-Menten y se ha estudiado la fotofísica del fluoróforo DCM-NH2 liberado. Además, el DCMNH2 cumple los requisitos para su uso en microscopía de superresolución. Con esta metodología se ha conseguido mostrar que en bacterias con alta actividad pepN, los sitios de producción de la enzima se encuentran situados principalmente en la membrana bacteriana, así como en algunas estructuras del interior del cuerpo bacteriano. Adicionalmente, se ha demostrado la utilidad de este sensor en la medida de la actividad enzimática durante la formación de biofilms bacterianos. En lo que respecta al sensor DCM-NH-Pro-Gly, cuando el grupo dipéptido es liberado por la acción enzimática específica de la DPP IV, de nuevo el ICT del DCM-NH2 se restablece, formando un sistema que muestra una elevada fluorescencia ratiométrica. Con esta nueva sonda, se ha podido detectar, rápida y eficazmente, la actividad enzimática de la DPP IV en células vivas y tejidos humanos cancerígenos, tanto de colon como de riñón, así como en organismos enteros, utilizando el pez cebra, en el que se ha seguido la expresión cuantitativa de la actividad de DPP IV con los días post fecundación (dpf) de los peces, mediante el cálculo cuantitativo de la intensidad de fluorescencia NIR. En adición a estos resultados y debido a la posibilidad de la excitación multifotónica, se ha podido detectar cuantitativamente, la actividad de DPP IV en el suero humano de una forma directa, sin la necesidad de tratamientos adicionales que eliminen la autofluorescencia (y el posterior e incontrolable fotoblanqueo) que muestra el suero humano cuando se excita por un solo fotón de luz visible. Por último, el sustrato DCM-HBU libera la ya mencionada señal fluorescente NIR tras una oxidación mediada por TYR seguida de la hidrólisis del enlace ureico. Como se ha indicado en los casos anteriores, el colorante liberado muestra la característica fluorescencia ratiométrica. En este caso, la posibilidad de la excitación multifotónica permite la obtención de imágenes de fluorescencia en tejidos de melanoma (en los que TYR está sobreexpresada) a mayores profundidades tisulares que las sondas hasta ahora propuestas, debido a que tanto la luz de excitación como la de emisión tienen una longitud de onda que evita los inconvenientes que acarrea la luz UV y Visible en los sistemas biológicos, como son la absorción celular, la autofluorescencia y la dispersión. Además, la sonda también es útil para la detección cuantitativa de la actividad TYR en organismos completos, como se ha demostrado en larvas de pez cebra con actividad TYR. Se espera que esta nueva sonda fluorescente NIR, bifotónica y ratiométrica sea útil para la detección precisa de TYR en biosistemas complejos a mayor profundidad que otras sondas fluorescentes anteriormente propuestas. Se debe resaltar que los estudios de inhibición para las tres enzimas, tanto in vitro como in vivo, revelan claramente que los sensores son sensibles a la actuación de su enzima correspondiente. Así, cuando esta es inhibida, el sustrato no sufre alteraciones significativas en sus propiedades fotofísicas.