Origen y diversidad del intersticio cardíaco

Resumen

I. INTRODUCCIÓN I.1. Antecedentes El intersticio cardiaco es el espacio extracelular que queda entre las células musculares del corazón (cardiomiocitos). Históricamente se lo ha considerado un compartimento estanco que daba soporte a los cardiomiocitos a modo de tejido conectivo. Sin embargo, durante las últimas décadas se ha descubierto que el intersticio cardíaco tiene un papel fundamental en el mantenimiento del equilibrio fisiológico (homeostasis) del órgano cardíaco en condiciones normales (fisiológicas), así como en las respuestas reparativas del corazón a condiciones adversas, lo que lo convierte en un elemento determinante en la progresión de patologías cardíacas. El intersticio cardiaco está formado tanto por una matriz extracelular (MEC) característica como por un conjunto de células intersticiales (CIC). La MEC intersticial está compuesta de una red de colágeno y otras proteínas estructurales íntimamente unidas a los cardiomiocitos y a las CIC a través de complejos de adhesión célula:matriz y célula:célula como las integrinas y cadherinas, entre otras moléculas. El conjunto del intersticio cardíaco constituye un bloque funcional que contribuye a la integridad del miocardio, un tejido en continuo movimiento. Por otra parte, las CIC son un conjunto heterogéneo de células con un origen poco estudiado y unas propiedades biológicas complejas. Las CIC son un tipo celular extraordinariamente abundante en el corazón. A pesar de que su tamaño es reducido si lo comparamos con el de los cardiomiocitos, el número de CIC supera con creces el de células musculares del corazón, alcanzando según algunos estudios incluso el 70% de las células del órgano. Tal y como hemos indicado las CIC son una población heterogénea que incluye cardiaco células endoteliales, musculares lisas y pericitos del sistema vascular coronario, así como varias poblaciones de células madre cardíacas de origen discutido, macrófagos y otras células de estirpe sanguínea y fibroblastos. Estos últimos son los responsables de la estructura de la matriz extracelular a través de la regulación del metabolismo del colágeno. En la última década, ha crecido exponencialmente el número de artículos científicos donde se detalla la función del fibroblasto cardíaco (FC) en relación a la capacidad adaptativa del corazón a condiciones adversas. En condiciones normales al FC se le atribuye funciones tanto de colaboración en la transmisión del potencial de acción entre poblaciones aisladas de cardiomiocitos pero también funciones de aislamiento eléctrico entre grandes poblaciones de cardiomiocitos (p.ej. las de los atrios y ventrículos). Por otro lado los FC regulan la degradación y síntesis de colágeno, lo que les permite modificar la histoarquitectura del corazón en función de las necesidades de bombeo cardiaco. En condiciones patológicas tales como las que siguen a un episodio isquémico severo (p.ej. infarto de miocardio), los fibroblastos son responsables de la respuesta no adaptativa del corazón a la muerte del músculo cardíaco. Dicha respuesta incluye una activación, movilización y crecimiento de la población fibroblástica, la secreción de moléculas proinflamatorias primero y de colágeno después, articulando la formación de una cicatriz cardiaca producida tras un A pesar de su gran importancia, los mecanismos celulares por los que se regulan y los mecanismos moleculares que llevan a la formación de la cicatriz generada tras el infarto siguen siendo en parte desconocidos. I.2. Fibroblastos cardíacos: un ¿cajón de sastre¿ celular El concepto de ¿fibroblasto¿ hace referencia a todo aquel tipo celular que, en cualquier tejido, se encuentra formando parte del tejido conectivo que se dispone entre o alrededor de un parénquima celular especializado y que tiene función de sostén y/o protección para dichas células. Los fibroblastos suelen definirse por su morfología y posición in vivo así como por su capacidad de adherencia a la matriz extracelular, su respuesta a estímulos inflamatorios y la secreción y degradación controlada de colágeno y otras proteínas de la matriz extracelular. Dada que estas características son vagas y en buena medida tienen carácter funcional, el estudio de los fibroblastos ha sido complejo. Muchos estudios han descubierto y descrito moléculas consideradas como ¿marcadores¿ de fibroblastos, en un intento de identificar dichas células in situ. El pro-colágeno 1, la enzima sintética de colágeno prolil-hidroxilasa 4, la proteína secretora de fibroblastos-1 (FSP1/S100A4), el receptor tipo 2 de dominios de discoidina (DDR-2), el receptor de ácido hialurónico CD44, Thy.1/CD90, la periostina e incluso la actina de musculatura lisa tipo alfa (¿-SMA) son algunas de las moléculas que han sido consideradas como marcadores de fibroblastos cardíacos. Sin embargo, numerosos estudios han demostrado que dichos ¿marcadores¿ no son expresados por todos los fibroblastos, que su nivel expresión difiere mucho entre poblaciones de fibroblastos aparentemente similares y que otros tipos no fibroblásticos también los expresan. Además, varios estudios de expresión génica masiva por microarrays en fibroblastos obtenidos de diferentes tejidos revelan perfiles de expresión muy diversos. Esta diversidad genética se pone de manifiesto tras la reprogramación de fibroblastos aislados de diferentes órganos en células madre pluripotentes inducidas (iPS), ya que iPS obtenidas a partir de distintas poblaciones de fibroblastos presentan marcadas diferencias en cuanto a su capacidad de diferenciación, por ejemplo, a cardiomiocitos. Todos estos datos muestran de forma clara que bajo el término ¿fibroblasto¿ convergen una serie de células con características y comportamientos distintos, definidos fundamentalmente por el grado de adaptación a unas condiciones concretas y a su fondo genético. Esto es algo evidente en el corazón de los mamíferos adultos: el análisis post mortem de corazones femeninos trasplantados a pacientes varones que han sufrido un infarto han demostrado que un número muy significativo de células extracardíacas (positivas para hibridaciones in situ contra el cromosoma Y) habían poblado el corazón, siendo algunas de ellas, incluso, de naturaleza miocárdica. Esto supuso una revolución científica en el campo de la investigación cardiovascular y llevó a destacar la heterogeneidad de los tipos celulares del corazón, y muy especialmente el del compartimento ¿fibroblastico¿ del corazón. I.3. Origen de los fibroblastos cardíacos Se han descrito varios orígenes para los fibroblastos cardíacos, aunque la médula ósea, el endotelio/endocardio y el epicardio se consideran las más importantes.. 2.1. El epicardio como fuente de fibroblastos cardíacos durante el desarrollo embrionario Durante el desarrollo embrionario, el epicardio es el primer tejido extra-cardiaco que llega al corazón. El primordio cardíaco tubular, una vez se inicia la torsión, está formado solo por dos capas de células (endocardio y miocardio). El epicardio, proveniente de una estructura mesodérmica derivada del septo transverso (el proepicardio), cubre de forma paulatina el corazón, de forma tal que el órgano queda ahora formado por tres capas distintas de tejido (endocardio, miocardio y epicardio). El epicardio no es una capa estática, sino que tiene un papel fundamental en el correcto desarrollo del corazón, como han demostrado diversos estudios en los que la eliminación selectiva de genes que son clave para el desarrollo del epicardio (p.ej. el gen supresor del tumor de Wilm¿s, Wt1) causa la muerte temprana del embrión por graves defectos cardiacos. Durante el desarrollo embrionario las células epiteliales que conforman el epicardio embrionario sufren una transformación epitelio-mesénquima que da lugar a una población que migra hacia las capas celulares más internas del corazón y se va diferenciando en diferentes tipos de células intersticiales, incluyendo células musculares lisas y endotelio coronario así como un gran número de células mesenquimáticas, de aspecto fibroblástico, que se incorporan al intersticio. Además de esta contribución directa de las células epicárdicas a la formación de otras estructuras, el epicardio secreta factores de crecimiento y morfógenos que a través de mecanismos autocrinos y paracrinos favorecen el crecimiento y maduración del músculo cardíaco. 2.2. La médula ósea como fuente de fibroblastos cardíacos en situaciones patológicas Múltiples estudios han demostrado que células provenientes de la médula ósea anidan en el corazón tras una situación isquémica severa, como sucede durante el infarto de miocardio. Además, se ha descrito que dichas células juegan un papel crucial en el desarrollo del infarto, ya que por un lado participan en la secreción de factores pro y anti-inflamatorios clave y por lo tanto en la regulación de la respuesta inflamatoria a corto y medio plazo tras la isquemia local. Por otro, se ha descrito la diferenciación de células derivadas de la médula ósea a fibroblastos productores de colágeno y con capacidad motil, que han recibido el nombre de ¿fibroblastos activados¿, y a los que se considera esenciales en el proceso de cicatrización que caracteriza a la remodelación ventricular porst-infarto. Se han descrito diferentes poblaciones de células procedentes de la circulación/médula ósea en el corazón, incluyendo macrófagos (F4/80, CD80+), monocitos (CD62+), linfocitos (CD4 o CD8), progenitores (CD117 / ckit+, CD44+)- en diferentes momentos y con roles distintos en el corazón infartado, pero se desconoce en gran medida su función, sobre todo en relación al en el que alcanzan el corazón y la interacción con otras células residentes del intersticio cardiaco. En este contexto, el primer capítulo experimental de esta tesis doctoral se centra en la descripción del aporte del epicardio y de las células circulantes al intersticio cardiaco desde su formación durante el desarrollo embrionario (estadio E11.5 días en ratón) hasta el período neonatal y adulto. II. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS La hipótesis general en la que se basa esta tesis es que las células derivadas del epicardio embrionario que residen en el intersticio cardiaco adulto responden a estímulos patológicos a través de programas genéticos y de señalización propios de su origen embrionario. El objetivo principal de estas tesis es estudiar el papel que las células de estirpe epicárdica incorporadas al intersticio cardíaco juegan tanto en el mantenimiento de la homeostasis cardíaca como en las respuestas patológicas a daño cardíaco. Para ello se han diseñado experimentos que permiten el trazado de las células, el estudio de su perfil molecular así como de su interacción con otros tipos celulares no epicárdicos en diferentes condiciones. También se han realizado estudios sobre vías moleculares de señalización que están implicadas tanto en el desarrollo embrionario del epicardio como en las respuestas patológicas de los derivados epicárdicos en el adulto. III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN III.1. Estudio del origen del intersticio cardiaco Para estudiar el aporte de células epicárdicas y circulantes al intersticio cardiaco desde su formación se ha recurrido a la combinación de varias técnicas de trazado celular en varios modelos animales. En primer lugar, mediante quimeras pollo / codorniz, es posible seguir el destino de las células del proepicardio de codorniz en el corazón en desarrollo del pollo, para lo que se emplean anticuerpos específicos (QCPN para los núcleos celulares de codorniz y QH1 para células hematopoyéticas y endoteliales de la codorniz). Este método fue desarrollado hace más de 15 años por el Dr. Pérez Pomares, director de esta tesis doctoral, y permitió probar el aporte de células del epicardio a diversas estructuras del corazón en desarrollo y ahora se ha usado de nuevo para probar el papel pionero de las células derivadas del epicardio en la colonización del intersticio cardíaco. Otro tipo de quimeras desarrolladas en esta tesis doctoral (experimentos de parabiosis pollo/codorniz, en los que la circulación de ambos embriones se fusiona en una única red vascular) demuestran que no hay aporte de células circulantes al intersticio del ventrículo en desarrollo en los primeros estadios embrionarios (al menos, hasta los primeros 9 días de desarrollo del pollo / HH35). En segundo lugar, se ha analizado la organización celular del intersticio cardiaco desde su inicio (estadio E11.5) hasta un estadio perinatal (E17.5) mediante dos métodos distintos. Por un lado se han usado ratones transgénicos en los que el linaje mesodérmico de células que expresan el gen Wt1, y que en el corazón contribuye esencialmente a la formación del epicardio, puede ser identificado por la expresión permanentemente de la proteína amarilla fluorescente-YFP. El estudio de los tejidos cardíacos de embriones de estos ratones, a los que denominamos Wt1Cre-YFP, ha revelado que las primeras células que pueblan el intersticio cardiaco en formación son de son de linaje Wt1/epicárdico. Por otro, se ha realizado el análisis del reclutamiento de células circulantes en el intersticio del ratón embrionario, localizando con técnicas inmunohistoquímica células CD34+/CD45+ en el intersticio cardíaco. En ninguno de los estadios estudiados (E11.5, E15.5 y E17.5) se ha encontró un número significativo de células circulantes integradas en el intersticio cardiaco. En otra serie de experimentos se procedió al análisis de la estructura celular del intersticio cardiaco de ratones adultos (entre 5 y 6 meses de edad). Para ello, se usado como animal de experimentación los mismos ratoones Wt1Cre-YFP). El estudio demuestra que también existen células intersticiales cardiacas derivadas de linaje Wt1 en condiciones normales durante la vida adulta del animal. En paralelo se procedió a evaluar la participación de células originadas en la médula ósea en la construcción del intersticio cardíaco. Para ello se usaron ratones gamma-irradiados y posteriormente, trasplantados con la médula ósea de ratones transgénicos constitutiva que expresaban las proteínas eGFP o mRFP. De esta forma, se identificó un aporte muy significativo de células derivadas de la médula ósea al intersticio cardiaco durante la vida adulta en condiciones fisiológicas. Por último, este primer bloque de resultados se completa con un análisis de la distribución de células intersticiales YFP+ en diferentes regiones anatómicas del corazón desde E11.5 hasta la vida adulta. Dicho análisis demuestra que las células YFP+ son muy abundantes en el lado izquierdo del corazón, incluyendo el ventrículo izquierdo y la porción izquierda del septo interventricular. También ponen de manifiesto que la región del ápice ventricular es la que presenta un mayor número de células intersticiales YFP+ derivados de epicardio. Este aspecto es interesante ya que en esa región cardíaca se ha descrito la mayor abundancia de células madre cardiacas residentes (c-Kit+). III.2. Análisis del intersticio cardiaco en condiciones patológicas Dado que los resultados presentados en los apartados demuestran que las células de linaje Wt1 son una fuente muy importante de células intersticiales cardiacas en condiciones fisiológicas (tanto durante el desarrollo embrionario como en el periodo postnatal y la vida adulta), el siguiente grupo de experimentos ha tratado de estudiar la participación y respuesta de los dos tipos mayoritarios de células en el intersticio cardíaco (derivadas del epicardio y de la médula ósea) en una situación patológica (infarto de miocardio) causada por isquemia severa. Para ello se ha usado un método quirúrgico que consiste en la ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD), que irriga la mayor parte del ventrículo izquierdo. Dicha ligadura ha sido realizada en ratones adultos Wt1Cre-YFP y los corazones se analizaron tras una semana de la inducción del infarto. El resultado muestra que aproximadamente el 50% de las células que se encuentran en la región infartada son YFP+, demostrando su procedencia del linaje Wt1. En un infarto de miocardio se reconocen claramente tres regiones estructuralmente distintas. Por un lado, la región del infarto per se, donde se produce la muerte masiva de los cardiomiocitos; a continuación, la región del borde del infarto, limítrofe a la región infartada; y, por último, la zona que estructuralmente no se ve afectada por el infarto, denominada zona remota. La caracterización celular del infarto reveló diferencias en la distribución de tipos celulares entre estos territorios. La zona infartada presentó un número anormalmente elevado de células (alta condensación nuclear identificada con DAPI), dispuestas de forma desordenada y con ausencia evidente de cardiomiocitos. En la zona del borde del infarto la histomorfología es similar a la del miocardio remoto o no afectado e incluye un número elevado de células, tanto musculares como no musculares. En zonas remotas al infarto no se detectaron diferencias significativas en comparación a las condiciones normales. A lo largo de la zona del infarto, se encontraron células derivadas de la circulación (CD4+, CD8+, CD62+, CD80+, F4/80+), algunas integradas en el corazón (morfología fibroblástica) y otras circulantes (con morfología redondeada característica). Al mismo tiempo, la detección de marcadores inflamatorios (TNF-¿ e IL-6) se reveló asociada a células que no expresaban YFP. Todas las células de estirpe sanguínea que se encontraron integradas en las paredes ventriculares se disponían en estrecho contacto con células de aspecto fibrobástico YFP+. En la zona del infarto, se procedió al análisis de las células YFP+ mediante marcadores específicos de diferenciación a músculo liso (¿-SMA) o endotelio (CD31), lo que permitió demostrar que la mayoría de células YFP+ observada era negativa para ambos marcadores. Para comprobar su naturaleza fibroblástica, se empleó un marcador clásico para fibroblastos cardiacos: FSP1. Sorprendentemente, el número de células FSP1+ encontrado fue elevadísimo comparado con el de la zona remota o con la región del borde del infarto. Sin embargo la gran mayoría de estas células no expresaba YFP. Para valorar el aporte de células derivadas de la médula ósea al infarto y el potencial de interacción con las células de linaje Wt1 (YFP+), se procedió a la gamma-irradiación y posterior trasplante de médula ósea de ratones mRFP+ a ratones Wt1Cre-YFP+ lo que permite marcar dos linajes celulares distintos con dos proteínas celulares diferentes. Posteriormente, se procedió a la ligadura de la LAD de estos ratones y al análisis del corazón a las 24 horas y a los siete días post-infarto. Este complejo experimento demostró que la contribución de los dos tipos celulares, identificados por la expresión de YFP o RFP, cambiaba a lo largo del tiempo y dependiendo de la zona del corazón identificada. Al contrario de lo que ocurre tras 7 días tras el infarto, en el que el número de cñelulas YFP+ en la zona del infarto es muy abundante, a las 24 horas post-infarto no se apreciaron cambios en el número de células YFP+ en todo el corazón, incluyendo la región infartada. Por el contrario, la población RFP+ es muy abundante, aunque el grueso de la población se encontró en la región más cercana a la ligadura coronaria. La distribución espacial de la población s RFP+ se concentra en las regiones subendocárdica y subepicárdica. La caracterización realizada por inmunohistoquímica reveló que el número de linfocitos T CD4+, linfocitos T citotóxicos (CD8+), monocitos CD62+, macrófagos (F4/80+; CD80+), células progenitoras (c-Kit+) así como la expresión general de citoquinas inflamatorias (TNF-¿ e IL-6) era reducido solo 24 horas después del infarto. Todos estos tipos celulares, así como las citoquinas inflamatorias, son sin embargo frecuentes a los 7 días post-infarto. III.3. Estudio de células Wt1+ derivadas de epicardio Dado su papel como células pioneras en el intersticio cardiaco en desarrollo, su presencia en el intersticio adulto y su clara implicación en el desarrollo de la cicatriz derivada del infarto, en las siguientes secciones de esta tesis doctoral se procedió a la caracterización molecular y celular de las células Wt1+ derivadas del epicardio. Para ello se siguieron dos estrategias experimentales: por un lado se ha generó una línea celular inmortalizada (EPIC) a partir de epicardio embrionario de ratón (E11.5). Por otro se procedió al estudio de los patrones de expresión molecular de la vía de señalización de los factores secretados Wnts, que articulan una vía de señalización celular relevante para el desarrollo del epicardio y sus derivados y que además participa en la remodelación ventricular post-infarto. III.3.1. Caracterización de la línea EPIC La línea EPIC fue generada a partir de explantes de corazones embrionarios de E11.5. Desde un punto de vista celular, la línea EPIC presenta un fenotipo heterogéneo, ya que aunque la mayoría de las células de la línea son mesenquimales (confirmada por la expresión por PCR de marcadores como Sox9), también se encontraron colonias epiteliales (ZO-1+, pan-cadherina). Se procedió a la comparación de las EPIC con células proepicárdicas y epicárdicas directamente extraídas de embriones mediante análisis de PCR y de inmunohistoquímica. Los resultados del estudio revelaron que la línea EPIC sólo retiene una porción del potencial de diferenciación de las células epicárdicas embrionarias, específicamente aquel que le permite diferenciarse en fibroblastos y musculatura lisa. Una vez validado el modelo celular para los linajes descritos, se estudió en detalle la respuesta de la línea EPIC a medios condicionados con TGF-ß1 y 2, dos moléculas clave en la activación de los fibroblastos tras el infarto y en su transformación en miofibroblastos. Tras la inducción analizamos la expresión de proteínas musculares mediante inmunohistoquímica (SM22 y MHC) y PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR). El resultado indica el incremento de la expresión de ambos genes y proteínas en las células, pero no del número de células que las expresan. Siguiendo con la caracterización de las EPIC, se realizaron una serie de ensayos funcionales para valorar la capacidad de esta línea celular para modificar la matriz extracelular. En primer lugar, se realizó un ensayo de cultivo en geles de fibrina en medios condicionados por factores de crecimiento expresados en el corazón en respuesta a daño (BMP, VEGF, FGF, Wnts). Se observó una respuesta selectiva por parte de la línea celular, de forma tal que las células respondieron a BMP2 y VEGF formando yemas en el borde del cultivo. Por el contrario, en presencia de FGF, Wnt3a y Wnt5a, la degradación de la fibrina se reduce de forma muy marcada y desaparece el fenotipo de gemación descrito con anterioridad. De forma complementaria estudiamos el perfil de expresión de diferentes moléculas relacionadas con la regulación de la matriz extracelular (MMP, TIMPs, ADAMs) por qPCR y se encontró que las EPIC presentaban mayor expresión de MMP11, ADAM15 y TIMP1, 2 y 3 en comparación con el corazón embrionario de E11.5 días. Estos resultados sugieren que las EPIC tienen un programa proteolítico específico. Por último, y dada la heterogeneidad descrita en la línea celular, se procedió al aislamiento de 8 clones diferentes a partir de la línea celular EPIC original. Un ensayo de proteólisis frente en geles de fibrina, complementado por un análisis de expresión génica de MMP, TIMPs y ADAMs por qPCR, demostró que cada clon tenía unas características diferenciales propias en relación a su capacidad de degradar y migrar sobre la matriz extracelular de fibrina. En conjunto, este bloque de resultados sugiere que en la línea EPIC es un modelo de interés para el estudio de la biología de las células intersticiales derivada de epicardio. III.3.2. Señalización por Wnts en progenitores epicárdicos y sus derivados La ruta de señalización por Wnt está implicada en el desarrollo del corazón. Sin embargo, no existe mucha información acerca del papel de los Wnts en la diferenciación de células el proepicardio y sus derivados. Con el objetivo de conocer en detalle el papel que los Wnts juegan en el desarrollo del proepicardio (progenitores epicárdicos), y por extensión en el tracto de entrada del corazón, se siguieron varias estrategias. La primera consistió en el análisis molecular diferencial de elementos de la ruta de los Wnts por qPCR entre diferentes regiones del corazón embrionario de pollo: proepicardio, seno venoso, ventrículo y tracto de salida. Se estudiaron 53 genes y se encontró un patrón de expresión diferencial entre ellos. En concreto, Wnt2b, 4, 6 y 9b fueron las moléculas más expresadas en el proepicardio. Estos resultados se corroboraron por hibridación in situ (ISH). En paralelo, se desarrollaron una serie de ensayos funcionales in vitro a partir de explantes de proepicardios de pollo en diferentes medios condicionados por activadores e inhibidores de Wnts y se estudió su efecto sobre la capacidad de diferenciación a músculo cardiaco por inmunohistoquímica. Los resultados sugieren que la activación de la ruta canónica de los Wnts, caracterizada por la traslocación al núcleo de la ß-catenina, favorece la diferenciación a músculo cardiaco de los progenitores proepicárdicos in vitro en detrimento de las poblaciones fibroblásticas. Por último, se seleccionaron elementos de la vía de los Wnt cuya expresión en los tejidos de interés era relevante para analizarlos en los tejidos de ratón equivalentes. Se descubrió que las moléculas seleccionadas por su elevada expresión en el proepicardio de pollo (Wnt 2b, 4, 6, 9b) tenían una expresión mínima o nula en proepicardios de ratón. Sin embargo, otros elementos relacionados con la señalización por Wnts se expresaban a altos niveles en el proepicardio de ratón, lo que sugiere que los elementos responsables de la señalización por Wnts son distintos en estos dos modelos. De forma complementaria se estudió la activación de la ruta canónica de señalización por Wnts usando como modelo un ratón transgénico (denominado BAT-GAL) que permite seguir la activación de dicha ruta a través de la translocación de la ß-catenina (efector de la vía de señalización) y la subsiguiente expresión del reporter LacZ. El estudio de este ratón revela una activación heterogénea pero consistente de la vía canónica de los Wnt en el proepicardio y el septo transverso de embriones de E11.5. La expresión de la vía se reduce enormemente en cuanto las células proepicárdicas forman el epicardio sobre la superficie del miocardio.