Innovaciones nanotecnológicas en el desarrollo de plataformas analíticas para la evaluación de la seguridad agroalimentaria

Resumen

1. Introducción o motivación de la tesis Esta Tesis Doctoral ha tenido como objetivo el desarrollo de plataformas analíticas de respuesta rápida para su aplicación en análisis agroalimentario con el uso de nanoestructuras incorporadas como herramientas analíticas con diferente finalidad utilizando sistemas dinámicos convencionales o implementados a escala micrométrica. Para ello, se han incluido innovaciones en los métodos de síntesis de dichas nanoestructuras, así como en el empleo de plataformas analíticas separativas con diferente fundamento para su separación y caracterización. Entre las nanoestructuras desarrolladas se encuentran diversos tipos de nanopartículas (NPs) y bicapas lipídicas (liposomas), así como de nanomateriales de carbono bidimensional, como grafeno. Entre las NPs sintetizadas, cabe destacar las NPs híbridas, principalmente tipo core-shell de NPs metálicas de oro con un núcleo magnético de NPs de óxidos de hierro, cuya superficie se ha modificado para conferirles carácter hidrofóbico (Fe3O4@AuNPs-C12SH). Los liposomas son estructuras autoensambladas cuya utilidad como contenedores analíticos favorece diferentes funcionalidades a lo largo del proceso analítico. Por una parte, la incorporación de las NPs, formando magnetoliposomas (MLs), los dotan de capacidad de retención magnética en la zona de reacción/detección de las plataformas analíticas determinativas desarrolladas. Por otra parte, el encapsulamiento de diferentes ingredientes involucrados en las reacciones analíticas o indicadoras, ejercen una importante función protectora y/o amplificadora respecto al desarrollo de la reacción analítica y la monitorización de la señal instrumental. Los nanomateriales de carbono bidimensional, en especial el grafeno, son buenos candidatos para proporcionar una fina capa receptora. Como este material tiene un átomo de espesor y posee grandes áreas de hibridación sp2, se ha usado para la inmovilización de reactivos y así originar superficies activas en el desarrollo de plataformas analíticas biosensoras. Uno de los retos a conseguir respecto a la seguridad alimentaria se orienta hacia el desarrollo de metodologías que posibiliten la determinación de residuos de sustancias químicas tipificadas como xenobióticos en el área del análisis de alimentos. Se evidencia una demanda tecnológica para desarrollar metodologías analíticas más rápidas, sensibles, selectivas y precisas para la monitorización de residuos de xenobióticos. La aplicabilidad de las investigaciones desarrolladas se ha orientado hacia la determinación de residuos de antibióticos aminoglucósidos en alimentos. Se han propuesto diferentes opciones de plataformas analíticas determinativas basadas en el uso de sistemas dinámicos a escala microfluídica en las que se han integrado diferentes sistemas instrumentales para el seguimiento de las reacciones analíticas estudiadas. 2. Contenido de la investigación El objetivo genérico de las investigaciones propuestas en esta Tesis Doctoral ha sido implementar diferentes innovaciones nanotecnológicas para su incorporación en las nuevas plataformas analíticas diseñadas que permitan aportar información para la evaluación de la calidad agroalimentaria. Este objetivo genérico se ha subdividido en tres objetivos específicos que quedan reflejados en los tres apartados en que se ha estructurado el desarrollo transversal de las investigaciones realizadas: (a) Síntesis, separación y caracterización de los materiales y/o nanoestructuras a incorporar en las diferentes partes de los sistemas dinámicos, ya sea como dispositivos de anclaje e integración instrumental, como elementos que favorezcan la retención de nanoestructuras o reactivos, o como reactivos propios que participan en las reacciones analíticas involucradas. (b) Propuesta de plataformas analíticas con carácter separativo y/o determinativo basadas en el acoplamiento en sistemas continuos convencionales o a escala microfluídica, que aporten información sobre el resultado de la separación de los nanomateriales posterior a su síntesis. (c) Demostración del potencial analítico de las plataformas desarrolladas para la evaluación de la seguridad agroalimentaria. Esta Memoria se ha estructurado en tres bloques, precedidos por una Introducción, en la que se comentan algunos aspectos básicos relacionados con los contenidos estudiados y una sección en la que se muestran las principales Herramientas instrumentales y metodológicas para el desarrollo de las plataformas analíticas y su aplicación en análisis agroalimentario. En este contexto, en la Parte Experimental se han incluido las siguientes investigaciones: El Bloque I se centra en la síntesis, separación y caracterización de diferentes nanomateriales utilizados a lo largo de las investigaciones desarrolladas. Para ello, se han desarrollado diferentes plataformas analíticas en las que el resultado de la separación de los nanomateriales, basada en diferentes fundamentos, se ha acoplado a sistemas de detección para su monitorización y caracterización de los nanomateriales separados. Este bloque ha dado lugar a las siguientes publicaciones: - Desarrollo de un método de separación de NPs híbridas tipo core-shell con núcleo de magnetita recubiertas con NPs de oro y una superficie hidrofóbica (Fe3O4@AuNPs-C12SH) mediante centrifugación en gradiente multifase de densidad (MDGC). La separación se ha monitorizado mediante el acoplamiento del vial de separación a un sistema de flujo continuo de análisis con detección de dispersión de la radiación [1]. - Monitorización mediante un sistema de flujo continuo con detección luminiscente del resultado de la separación de poblaciones de liposomas mediante MDGC posterior a la síntesis de MLs híbridos en los que han encapsulado Fe3O4@AuNPs-C12SH y distintos fluoróforos [2]. - Separación y caracterización de las distintas poblaciones obtenidas después de la síntesis de varios tipos de liposomas utilizando la técnica AF4-MALS y la comparación de los resultados obtenidos con otras técnicas, como TEM y DLS [3]. En el Bloque II se ha desarrollado una plataforma analítica para monitorizar el resultado de la separación MDGC de los liposomas híbridos sintetizados por acoplamiento a un sistema microfluídico que se ha integrado en el sistema de detección, un espectrofluorímetro convencional, mediante el uso de un dispositivo de anclaje y focalización fabricado mediante tecnología de impresión 3D. Este bloque a dado lugar a una publicación: - Integración de un sistema microfluídico en un detector luminiscente convencional usando un dispositivo de alineamiento diseñado y obtenido por impresión 3D. En el sistema también se integra el dispositivo de retención magnética y los elementos de focalización de la radiación incidente [4]. Finalmente, en el Bloque III se han propuesto dos metodologías analíticas (bio)sensoras para la determinación de residuos de antibióticos aminoglucósidos en alimentos. Se ha descrito dos plataformas analíticas en dos publicaciones: - Desarrollo de un biosensor aptamérico basado en la unión covalente del aptámero a grafeno depositado sobre una superficie de oro para la determinación de residuos de kanamicina en alimentos mediante monitorización de la dispersión basada en la técnica de resonancia del plasmón superficial (SPR) [5]. - Desarrollo de una plataforma analítica sensora a escala micrométrica para la determinación de residuos de antibióticos aminoglucósidos basada en la integración de la zona de reacción/detección en un dispositivo microfluídico con retención electromagnética de parte de los ingredientes de la reacción analítica por encapsulación en MLs híbridos y detección fluorimétrica. La integración del sistema microfluídico en el compartimento de muestra de un espectrofluorímetro convencional se realiza mediante el sistema de anclaje construido mediante tecnología de impresión 3D [6]. 3. Conclusión En la presente Memoria se han desarrollado diferentes plataformas analíticas separativas y/o determinativas con diferente grado de integración con sistemas dinámicos de flujo convencional o desarrollados a escala microfluídica, para la monitorización de la eficacia en la separación de los nanomateriales híbridos sintetizados, así como para la determinación de residuos de antibióticos aminoglucósidos en alimentos. A continuación, se resumen las conclusiones más relevantes de las investigaciones realizadas: 1. Se han sintetizado y caracterizado diferentes tipos de nanomateriales híbridos, mediante modificaciones innovadoras de métodos clásicos. Cabe destacar los siguientes nanomateriales: - NPs híbridas con estructura core-shell con un núcleo de magnetita recubiertas con NPs de oro y haciendo su superficie hidrofóbica (Fe3O4@AuNPs-C12SH), que se han utilizado para su incorporación en la bicapa lipídica para formar MLs. - Liposomas híbridos sintetizados mediante la metodología de evaporación rápida de disolvente (RSE), permitiendo la incorporación de materiales con diferente funcionalidad a lo largo del proceso analítico. El encapsulamiento de estos materiales diversos dentro de los liposomas ha aportado aspectos innovadores en las metodologías desarrolladas, aportando una gran utilidad como contenedores analíticos: a) como dispositivos de transporte y de protección del material encapsulado a lo largo del proceso analítico, especialmente de compuestos involucrados en las reacciones analíticas, b) como dispositivos con capacidad magnética que facilita su retención en zonas claves de reacción/detección del proceso (bio)analítico, y c) como dispositivo con funciones de amplificación de la señal instrumental, ya que permiten el atrapamiento/liberación de reactivos preconcentrados en el interior de la vesícula lipídica. - Nanomateriales de carbono bidimensional (grafeno) utilizados como estructura base para la inmovilización de aptámeros selectivos en el diseño de un sensor aptamérico en continuo con detección mediante SPR. 2. Se han desarrollado diferentes plataformas analíticas separativas que permiten monitorizar el rendimiento de la eficacia en la separación de los nanomateriales sintetizados y de los residuos originados después de los procesos de síntesis. El proceso de separación se ha llevado a cabo mediante el uso de la metodología MDGC. Se ha estudiado el empleo de diferentes materiales con capacidad separativa en base a su efecto sobre la velocidad de sedimentación, así como el establecimiento de diferentes perfiles en el gradiente de centrifugación. Se han desarrollado dos tipos de plataformas separativas basadas en el empleo de sistemas dinámicos de flujo continuo a escala convencional y a escala micrométrica. Se han empleado diferentes sistemas de monitorización de la señal instrumental con diferente fundamento en función del tipo de nanomaterial separado, ya sea mediante medida de la dispersión de la radiación o mediante medida de la emisión luminiscente de los fluoróforos involucrados. 3. Se han separado diferentes poblaciones de liposomas híbridos mediante el uso de la técnica AF4-MALS. 4. Se ha establecido por primera vez una plataforma analítica integrada mediante el acoplamiento de un sistema microfluídico en el compartimento de muestra de un espectrofluorímetro convencional mediante el uso de un dispositivo de anclaje y focalización fabricado mediante tecnología de impresión 3D. Esta plataforma analítica se ha utilizado para la monitorización del resultado de la separación mediante MDGC de diferentes tipos de liposomas híbridos sintetizados. 5. Se ha desarrollado una plataforma analítica fundamentada en un biosensor aptamérico para la determinación de kanamicina en leche mediante la integración de nanomateriales de carbono bidimensional de grafeno depositado en la monocapa de oro situada en la superficie sensora del sistema de flujo acoplado en un detector de plasmón de resonancia superficial. 6. Se ha demostrado la utilidad de una plataforma analítica microfluídica integrada mediante tecnología 3D dentro de detectores luminiscentes convencionales en la que se han incorporado MLs híbridos (que contienen Fe3O4@AuNPs-C12SH y N-acetilcisteína) para la determinación de residuos de antibióticos aminoglucósidos en muestras de alimentos, utilizando a su vez o-ftalaldehído como reactivo derivatizante. 4. Bibliografía [1] Á. Écija-Arenas, V. Román-Pizarro, J.M. Fernández-Romero, A. Gómez-Hens, Separation and purification of hydrophobic magnetite-gold hybrid nanoparticles by multiphase density gradient centrifugation, Microchim. Acta. 183 (2016) 2005–2012. https://doi.org/10.1007/s00604-016-1838-z. [2] Á. Écija-Arenas, V. Román-Pizarro, J.M. Fernández-Romero, Luminescence continuous flow system for monitoring the efficiency of hybrid liposomes separation using multiphase density gradient centrifugation, Talanta. (2020). https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2019.135577. [3] Á. 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