Desarrollo de nuevas nanoplataformas funcionalizadas asociadas a 5-fluorouracilo como estrategia para la mejora de la respuesta al tratamiento del cáncer de colon

Resumen

El cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más frecuente en el mundo y el segundo cáncer más mortal, con aproximadamente 2 millones de nuevos casos y 100.000 fallecimientos en el año 2020. Su presentación es “asintomática” o con signos clínicos inespecíficos que pueden ser confundidos con otras patologías lo que provoca en muchas ocasiones, a pesar de los cribados realizados para su detección, un diagnóstico tardío. Su tratamiento, en fases tempranas de la enfermedad, se basa en la resección quirúrgica y/o la quimioterapia que incluye la administración del 5-fluorouracilo (5-FU), normalmente coadministrado con leucovorina (LV), el oxaliplatino (OXA) y el irinotecan (IRI), tanto de forma monoterapéutica como en combinación. No obstante, en estadios avanzados de la enfermedad se hace necesario la aplicación de quimioterapia junto a terapia adyuvante o neoadyuvante utilizando anticuerpos monoclonales del tipo de Cetuximab o Bevacizumab. A pesar de la reciente mejora en la supervivencia del CCR gracias a un diagnóstico más precoz a través de los sistemas de cribado y al desarrollo de nuevas terapias como Aflibercept, Ramucirumab, Regorafenib, Panitumumab, Pembrolizumab, entre otros, los numerosos efectos secundarios asociados a los fármacos quimioterápicos, la inespecificidad de los tratamientos y la aparición de quimioresistencia a los mismos, son las principales causas del fracaso en el tratamiento del CCR. Además, la imposibilidad de realizar resección quirúrgica sin límites comprometidos en muchos casos y las bajas tasas de supervivencia a 5 años en estadios avanzados (14.7%) hacen necesario el desarrollo de nuevas herramientas que mejoren la terapia de esta patología. En este contexto, las nanopartículas (NPs), unos sistemas de pequeño tamaño (1-200nm), con facilidad y versatilidad de síntesis y capaces de encapsular y vehiculizar fármacos, agentes de contraste o genes para el tratamiento del cáncer, se presentan como una gran oportunidad para la mejora del pronóstico de esta enfermedad. Estos sistemas han demostrado ser biocompatibles y biodegradables, mejorar la solubilidad de los agentes que vehiculizan y protegerlos de la degradación aumentando su tiempo de circulación en el organismo y, por tanto, el número de moléculas alcanzan el tumor. Además, gracias a su capacidad de funcionalización, las NPs pueden evitar la entrada de su carga en células no tumorales, aumentando la concentración de los fármacos específicamente en el sitio tumoral, pudiendo controlar su liberación y evitando mecanismos de resistencia de los fármacos. Aquellos nanosistemas que permiten la inclusión de núcleos magnéticos, no solo se benefician de las ventajas generales de las NPs, sino que las mejoran ya que facilitan su direccionamiento mediante un campo magnético, se concentran en el sitio tumoral y permiten la aplicación de hipertermia magnética al ser expuestos a un campo magnético alterno. En la presente tesis doctoral se han evaluado diferentes nanosistemas para la vehiculización de los agentes 5-FU y el OXA. Las nanoformulaciones utilizadas fueron sintetizadas por el Departamento de Química Orgánica de la Universidad de Málaga bajo la supervisión del Dr. Juan M. López Romero y el Departamento de Microbiología de Universidad de Granada bajo la dirección de la Dra Concepción Jiménez López. En primer lugar, se estudiaron nanosistemas basados en nanogeles de poli(N-isopropilacrilamida) (pNIPAM). Para mejorar el nivel de encapsulación de fármaco además de la dispersión de las mismas y la adicción de núcleos magnéticos de magnetita (Fe3O4), los nanogeles de pNIPAM se combinaron con otros polímeros como el ácido 3-butenoico (3BA), el ácido acrílico (AA) y la alilamina (AL) a diferentes ratios. Para incorporar núcleos magnéticos correctamente, estos se funcionalizaron con 3BA (@Fe3O4-3BA) y AA (@Fe3O4-AA) y se usaron como semillas para la polimerización de pNIPAM y la combinación de pNIPAM y AL (pNIPAM-co-AL). Del amplio abanico de combinaciones posibles, se seleccionaron las siguientes síntesis para ser estudiadas en cultivos celulares: pNIPAM@ (NPs sin núcleo magnético), pNIPAM@Fe3O4-3BA y pNIPAM-co-AL@Fe3O4-AA. Adicionalmente, se incorporó el colorante fluorescente FITC al sistema pNIPAM-co-AL@Fe3O4-AA (pNIPAM-co-AL-FITC@Fe3O4-AA) para evaluar su capacidad como sistema de visualización y seguimiento. La biocompatibilidad de estas nanoformulaciones sin fármaco fue evaluada tanto en la línea tumoral de CCR T84 como en células sanguíneas humanas obtenidas de donantes sanos. Por un lado, se observó que ninguna de las nanoformulaciones estudiadas causaron toxicidad en la línea T84 ni en las células sanguíneas blancas humanas (WBC) a ninguna de las dosis y tiempos de exposición ensayados. Además, no produjeron la hemolisis de los eritrocitos humanos a excepción de pNIPAM-co-AL@Fe3O4-AA que indujo un ratio de hemolisis del ~6% a dosis elevadas (150 µg/ml). No obstante, ninguna de las nanoformulaciones originó aglutinación ni cambios de la morfología de los eritrocitos. En cuanto a sus propiedades de migración magnética, pNIPAM-co-AL@Fe3O4-AA mostró capacidad de migrar ante un campo magnético externo a dosis bajas (10 µg/ml). Finalmente, las NPs se cargaron con 5-FU (pNIPAM@+5-FU, pNIPAM@Fe3O4-3BA+5-FU, pNIPAM-co-AL@Fe3O4-AA+5-FU y pNIPAM-co-AL-FITC@Fe3O4-AA+5-FU) y OXA (pNIPAM@+OXA y pNIPAM@Fe3O4-3BA+OXA) y se estudió su efecto citotóxico en la línea celular T84. De las NPs estudiadas, pNIPAM@Fe3O4-3BA+5-FU fue la que mostró un mayor efecto citotóxico, similar al producido por el 5-FU en monoterapia. En segundo lugar, se estudiaron nanoplataformas basadas en núcleos magnéticos biomiméticos. En concreto, estos núcleos magnéticos de Fe3O4 de ~34 nm de diámetro se sintetizaron inorgánicamente mediante la intervención de la proteína asociada a la membrana del magnetosoma (MAPs), MamC, dando lugar a nanopartículas magnéticas biomiméticas (BMNPs). Los cristales de Fe3O4 resultantes no solo fueron estructuralmente diferentes a aquellos sintetizados de forma inorgánica sin MamC, sino que además mantuvieron dicha proteína unida de forma covalente a su superficie, aportando por tanto numerosos grupos para la funcionalización de las BMNPs. Para evaluar su biocompatibilidad, se estudió el efecto de las BMNPs en una amplia batería de líneas celulares de colon, células sanguíneas humanas (eritrocitos y WBC) y en la línea murina de macrófagos RAW 264.7. Las BMNPs mostraron una gran biocompatibilidad en líneas celulares tumorales, no obstante, en la línea de colon no tumoral CCD18, se pudo observar toxicidad a partir de 0.5 µg/ml de Fe debido a la sensibilidad de estas líneas a dosis altas de hierro. En cuanto a su hemocompatibilidad, las BMNPs no produjeron un nivel de hemolisis relevante (< 2%) en eritrocitos incluso a dosis muy elevadas de Fe (de 500 µg/ml). Sin embargo, se pudo observar grados crecientes de aglutinación de los mismos al aumentar la dosis. Por otro lado, en WBC y en la línea RAW 264.7, las nanoplataformas causaron una toxicidad dependiente de la dosis a tiempos de exposición cortos (1h), aunque dicha toxicidad se vio revertida transcurridas 12h en el caso de los WBC. El daño severo observado en la línea RAW 264.7, como se ha observado en otros estudios con NPs magnéticas (MNPs), se debe a la generación de altos niveles de estrés oxidativo. La evaluación de la capacidad de internalización de las BMNPs en las líneas celulares T84 y RAW 264.7 mediante Prussian Blue y microscopia electrónica de transmisión (TEM), determinó una internalización creciente dependiente de la dosis. Mediante TEM se determinó que las BMNPs fueron capaces de internalizarse en tan solo 15 min en la línea T84, probablemente mediante endocitosis mediada por clatrina. El estudio de la capacidad de las BMNPs de migrar en respuesta a un campo magnético externo (imán) de cara a un posible direccionamiento magnético in vivo, mostró una migración dependiente de la dosis. Así, se pudo observar que utilizando 100 µg/ml de Fe, prácticamente todas las células migraron hacia el imán. Esta migración no se observó en ausencia del imán. Finalmente, las nanoplataformas se cargaron con OXA (Oxa-BMNPs) y se estudió su efecto antiproliferativo en las líneas celulares de colon, pudiendo observarse, en todos los casos, una reducción de la IC50 con respeto a la del OXA administrado de forma libre. A pesar de su efectividad como sistemas de transporte de fármacos, las BMNPs mostraron algunos aspectos que comprometen su biocompatibilidad, por lo que se procedió a la adición de una cubierta y a la funcionalización de la misma. Las BMNPs y las Oxa-BMNPs se envolvieron por liposomas unilaminares de fosfatidilcolina de 100 nm o de 200nm (BMLs y Oxa-BMLs) y se funcionalizaron con polietilenglicol (PEG) en su superficie (BMLs-PEG y Oxa-BMLs-PEG) para mejorar su estabilidad y dispersión. Aunque las Oxa-BMLs y las Oxa-BMLs-PEG, tanto de 100nm como de 200nm, no mostraron una disminución de la IC50 del OXA libre tan marcada como las Oxa-BMNPs, ambas nanoformulaciones produjeron un efecto similar o mejor que el fármaco libre en todas las líneas estudiadas. No obstante, su biocompatibilidad se vio notablemente mejorada. En este caso, la toxicidad de las nanoformulaciones sin fármaco (BMLs y BMLs-PEG) en la línea CCD18 se vio enormemente reducida, observándose solo una ligera toxicidad a dosis elevadas. Además, tanto en la línea RAW 264.7 en como WBC su administración solo causó una toxicidad moderada a dosis elevadas, que en el caso de los WBC se vio revertida de nuevo, observándose en torno al 100% de viabilidad transcurridas 12h. En cuanto a su efecto sobre los eritrocitos, las BMLs mostraron un ratio de hemolisis superior al 3% mientras que en las nanoformulaciones pegiladas fue de < 2%, en consonancia con lo observado con las BMNPs y considerándose por tanto biocompatibles. Adicionalmente, no se observó aglutinación de los eritrocitos tras la administración de BMLs y BMLs-PEG. En cuanto a su capacidad de internalización y migración magnética, la adicción de una cubierta y su funcionalización con PEG no afectó a sus propiedades, que en todo caso mejoraron la internalización y migración en las BMLs-PEG, especialmente en las NPs de 100nm. En conclusión, los resultados del presente trabajo de investigación demuestran que las NPs sintetizadas basadas en pNIPAM (pNIPAM@, pNIPAM@Fe3O4-3BA, pNIPAM-co-AL@Fe3O4-AA y pNIPAM-co-AL-FITC@Fe3O4-AA) y BMNPs (BMLs y BMLs-PEG) fueron nanoformulaciones altamente compatibles en líneas celulares (incluidas las tumorales) y en células humanas sanguíneas, lo que avala su capacidad para ser usadas como transportadores de agentes terapéuticos. Además, las nanoplataformas BMNPs, BMLs y BMLs-PEG presentan una gran capacidad de internalización celular en las líneas celulares tumorales T84, SW480 y MC38 con capacidad de provocar migración magnética de dichas células. Asimismo, estas nanoplataformas (Oxa-BMNPs, Oxa-BMLs y Oxa-BMLs-PEG) fueron capaces de mejorar el efecto antitumoral del OXA libre. Estos resultados avalan la posibilidad de utilizar dichos nanoconjugados como potenciales herramientas terapéuticas para la mejora del tratamiento del cáncer en general y del CCR en particular.