Modificación del patrón de metilación del adn en el proceso de diferenciación neuronal de células madre mesenquimales

Resumen

Las lesiones en el sistema nervioso central (SNC) y los trastornos neurodegenerativos agudos constituyen la tercera causa de muerte más frecuente en Europa y Estados Unidos, solo por detrás del cáncer y las enfermedades cardiovasculares. Sin embargo, todavía no existen tratamientos eficaces para sustituir las células nerviosas dañadas. La medicina regenerativa propone el trasplante de células madre obtenidas de distintas fuentes y diferenciadas in vitro, como un método prometedor de reparación del tejido neuronal y son muchos los estudios clínicos que avalan su eficacia. No obstante, la aplicación clínica de esta metodología es muy reducida, debido sobre todo a la incapacidad actual de garantizar su bioseguridad a largo plazo. Este estudio pretende implementar un protocolo eficaz de inducción neuronal in vitro y profundizar en el estudio de los cambios epigenéticos que tienen lugar durante la diferenciación neuronal, en el afán de conocer mejor cuáles son los acontecimientos moleculares que tienen lugar en la célula y conseguir así prever el comportamiento de éstas una vez trasplantadas al paciente. Las células madre mesenquimales (MSCs) adultas derivadas de tejido adiposo (hASCs) ofrecen importantes ventajas prácticas frente a otros tipos de células madre en su potencial aplicación clínica, ya que pueden obtenerse en grandes cantidades, cultivarse y expandirse fácilmente y presentan muy bajo riesgo de desarrollar neoplasias malignas. En este trabajo se emplearon células madre humanas obtenidas de tejido adiposo (hASCs), concretamente de lipoaspirados, cedidosprevio consentimiento firmado por pacientes del hospital Virgen de las Nieves de la ciudad de Granada.Tras ser aisladas siguiendo un protocolo de extracción estándar, que incluye una digestión del tejido con colagenasa tipo I, las células fueron caracterizadas por citometría de flujo. Se obtuvieron porcentajes superiores al 98% para los marcadores mesenquimales CD73, CD105 y CD90 e inferiores al 2% para los marcadores hematopoyéticos CD45, CD34 y CD133. Este hecho confirmó que el experimento partía de un cultivo homogéneo de hASCs. El potencial de diferenciación neuronal de las hASCs fue estudiado empleando tres protocolos de diferenciación químicos. Dichos protocolos fueron llamados Neu1, de 21 días de duración, Neu2, de 15 días y Neu3, de 10 días. Todos ellos eran ricos en factores de crecimiento y otras sustancias que según la bibliografía consultada favorecían el proceso de neurogénesis. La diferenciación neuronal se llevó a cabo empleando células sembradas en monocapa y en neuroesferas para poder estudiar su comportamiento en tres dimensiones. Una vez finalizado el tiempo de inducción, la mayoría de las hASCs mostraron evidencias morfológicas de una especialización hacia linaje neuronal.Las hASCs adquirieron una morfología alargada y la aparición de prolongaciones citoplasmáticas a modo de neuritas, especialmente llamativas en el caso de las neuroesferas.Se estudió también la desdiferenciación de las células inducidas previamente. Para ello, se retiró el medio de inducción y se sustituyó por un medio de cultivo estándar durante la mitad del tiempo que duró la diferenciación neuronal, diez días en el caso de Neu1, siete días en Neu2 y cinco días en Neu3. Se observó un retorno hacia la morfología inicial, que fue más aparente en el caso de Neu1. También se observó la presencia de abundantes puentes citoplasmáticos intercelulares, más abundantes en el caso de Neu2. Para evaluar si existían evidencias inmunocitoquímicas de la diferenciación neuronal y la desdiferenciación, se estudiaron marcadores proteicos específicos del sistema nervioso por inmunofluorescencia de placas celulares fijadas y western blot de extractos proteicos de los cultivos celulares, para más de una docena de marcadores neuronales.También se estudiaron marcadores funcionales relacionados con la capacidad celular para transmitir impulsos nerviosos.Estos estudios se complementaron con Real Time PCRpara los mismos marcadores. La Nestina, proteína propia de células madre neuronales y la Tubulina, abundante en neuronas jóvenes, mostraron un incremento de expresión frente a los controles de hASCs sin tratar, más patente en células tratadas con Neu1. De los marcadores proteicos propios de neuronas maduras empleados, MAP-2, Neurofilamentos, Enolasa, Proteína Tau y Tirosina hidroxilasa, solo los tres últimos mostraron un incremento de marcaje frente al control, que fue más acentuado en Neu1 y Neu3 en los tres casos. GFAP se utilizó como marcador proteico de astrocitos y su marcaje fue ligeramente superior al control en Neu1 y Neu2. La proteína GalC se estudió como marcador de oligodendrocitos, obteniéndose un incremento de marcaje en Neu1 frente al control. En el caso de los marcadores funcionales, la acetiltransferasa (CHAT) mostró un aumento de marcaje tanto en Neu2 como en Neu3, y en el caso de la proteína SNAP25 todos los tratamientos presentaron un incremento de marcaje con respecto al control. En general, parece que los medios de diferenciación Neu1 y Neu3 fueron los que presentaron resultados más prometedores según todas las técnicas. Para estudiar los cambios que acontecían a nivel epigenético durante el proceso de diferenciación neuronal, se obtuvieron muestras de ADN y ARN para el análisis del metiloma y transcriptoma de las células madre mesenquimales diferenciadas y desdiferenciadas, que fueron enviadas al laboratorio de la Dra. María Berdasco en Barcelona, para someterse a arrays de metilación. El resultado de estos arrays permitió seleccionar un total de siete genes relacionados con la diferenciación celular y la neurogénesis, que presentaban una metilación diferencial frente a los controles, tres genes hipometilados (Hoxa-5, GRM4 y FGFR1) y cuatro hipermetilados (RETL1, METRN1, EN1 y Pax-9). Para confirmar los resultados de los arrays, se realizó una secuenciación con bisulfito de múltiples clones y Real Time PCR para comprobar que los cambios en el genoma se correlacionaban con una transcripción modificada de estos genes. Tras la realización de estas técnicas, los genes Hoxa-5 y Pax-9 fueron seleccionados como candidatos para el estudio funcional. Para estudiar la importancia del gen Hoxa-5, hipometilado tras la diferenciación neuronal, se planeó crear una línea estable de hASCs que lo sobreexpresara empleando dos metodologías. Se propuso la inserción estable del gen mediante una transfección con lentivirus y una activación transcripcional de su promotor mediante un sistema CRISPR/dCas9. En ambos casos se realizaron controles negativos transfectanto con sistemas no funcionales. Se realizaron estudios paralelos de western blot e inmunofluorescencia para demostrar la presencia del gen Hoxa-5 en las células transfectadas y se comprobó que su expresión era mayor en las hASCs tratadas con el sistema CRISPR/dCas9. A continuación se hicieron ensayos de expresión de marcadores neuronales en las líneas que sobreexpresaban Hoxa-5 para estudiar la importancia de este gen en el proceso de diferenciación neuronal. Los resultados mostraron que las células que sobreexpresaban este gen tenían mayor capacidad para expresar marcadores neuronales que los controles de hASCs sin tratar y que aquellas suplementadas además con el medio de diferenciación neuronal Neu1 maximizaban esta capacidad. Esto demostró que el gen Hoxa-5 juega un importante papel en la diferenciación neuronal activando rutas que en última instancia favorecen la expresión de marcadores neuronales. Se intentó estudiar también la importancia del gen Pax-9, hipermetilado tras la diferenciación neuronal, silenciando su expresión mediante la transfección con un ARN interferente pequeño (ARNip). Sin embargo, a causa de su baja expresión basal en hASCs sin diferenciar, los resultados no fueron concluyentes. En conclusión, la terapia con hASCs está experimentando avances importantes, con un número cada vez mayor de ensayos clínicos en todo el mundo. Sin embargo, es necesaria una mayor comprensión de su modo de acción a nivel epigenético y una estandarización de las prácticas de aislamiento, caracterización y trasplante con el objetivo de obtener resultados comparables, reproducibles y estables a largo plazo. No obstante, la tendencia al alza de las publicaciones relacionadas con estas células demuestra una intensa investigación para superar estos obstáculos.