Non-circulative virus transmission by aphidsnew insights into the mechanisms of transmission and the interference for retention sites in the vector

Resumen

En esta Tesis Doctoral se propone profundizar en el conocimiento de diversos conceptos sobre virus no-circulativos transmitidos por pulgones. El objetivo principal es generar nuevos conocimientos sobre el proceso de transmisión viral por pulgones que permita desarrollar nuevas estrategias que lleven a un mejor control de los virus vegetales. Concretamente, se han planteado los siguientes objetivos generales: 1. Estudiar el efecto del ayuno de pulgones en la transmisión de virus no-persistentes. 2. Estudiar la competencia e interferencia entre diferentes virus no circulativos por los lugares de retención en el vector. 3. Estudiar el comportamiento alimenticio de pulgones en relación a la transmisión de virus semipersistentes restringidos al floema. 4. Determinar la localización de los estiletes de pulgones en los tejidos de la planta durante la actividad clave asociada a la transmisión de virus semipersistentes restringidos al floema. La mayor parte de la experimentación de la presente Tesis Doctoral (objetivos 1, 2 y 3) se ha llevado a cabo en el Instituto de Ciencias Agrarias del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (ICA–CSIC) (Madrid, España). Parte de los ensayos dentro del objetivo 4 se realizaron en el marco de una Estancia Breve desarrollada en la Universidad de California Riverside (UCR) (EEUU) financiada por el Ministerio de Economía, Industria y Competitividad. Asimismo, el análisis de parte de las muestras de los experimentos dentro del objetivo 4 se llevaron a cabo en colaboración con la Universidad de Granada (UGR) (Granada, España). En cada uno de los objetivos de la presente Tesis Doctoral se empleó la técnica de Gráficos de penetración eléctrica (Electrical penetration graphs ‘EPG’ technique). Gracias a esta técnica pudimos monitorizar el comportamiento alimenticio de insectos con aparato bucal picador-chupador y asociar la posición del extremo distal del estilete en los diferentes tejidos de la planta. De esta manera, pudimos asociar las actividades de los estiletes del insecto a la inoculación y adquisición de virus vegetales. El primer objetivo de la Tesis Doctoral (Capítulo 4) tuvo como finalidad estudiar el efecto del ayuno de pulgones previo a la adquisición de virus transmitidos de manera no persistente (NP). Para ello, se usaron individuos ayunados y no ayunados de Myzus persicae y Aphis gossypii. Los pulgones se conectaron al equipo de EPG para monitorizar una prueba intracelular en una planta de calabacín infectada con Cucumber mosaic virus (CMV, Cucumovirus) con o sin ayuno previo. Posteriormente, los pulgones fueron trasferidos individualmente a una planta sana de calabacín para evaluar la tasa de transmisión de CMV mediante inspección visual y detección serológica mediante test de ELISA. Los registros de EPG mostraron un aumento de la actividad del pulgón asociada a la adquisición de virus no persistentes (Collar y Fereres, 1998) en individuos ayunados tanto de M. persicae como A. gossypii. Además, se observó un incremento en la transmisión de CMV en individuos ayunados de M. persicae en comparación con los no ayunados. Sin embargo, la eficacia en la transmisión de CMV fue similar entre individuos ayunados y no ayunados de A. gossypii. Por tanto, los resultados obtenidos demuestran que el ayuno de pulgones previo a la adquisición no siempre necesariamente aumenta la tasa de transmisión de todos los virus transmitidos de manera NP, como tradicionalmente había sido postulado para dicho tipo de transmisión viral (Watson, 1938; Powell, 1993). Esta diferencia en la eficiencia de transmisión entre individuos ayunados de M. persicae y A. gossypii sugirió posibles diferencias anatómicas en los estiletes de ambas especies o la presencia diferencial de compuestos en la saliva de dichos pulgones que puedan interferir o favorecer de forma específica la interacción con las partículas de CMV. En el segundo objetivo (Capítulo 5), se estudió la competencia e interferencia entre diferentes virus no-circulativos (NC) transmitidos por pulgones por los receptores existentes en el aparato bucal del vector. Para ello, se llevaron a cabo ensayos de transmisión secuenciales con períodos de adquisición fijos o monitorizados mediante EPG, tanto en plantas infectadas como en dieta artificial. Para el estudio de la competencia entre Cauliflower mosaic virus (CaMV, Caulimovirus) y Turnip mosaic virus (TuMV, Potyvirus), individuos de Brevicoryne brassicae fueron expuestos a plantas de nabo coinfectadas con TuMV y CaMV, mientras que para el estudio de la interferencia entre ambos géneros virales, los pulgones se expusieron a dos adquisiciones/transmisiones secuenciales, primero en planta de nabo infectada con CaMV o virus purificado en dieta artificial y posteriormente en planta de nabo infectada con TuMV. En los estudios correspondientes a la interferencia entre CaMV y CMV, se usaron individuos de M. persicae que adquirieron CaMV en una planta infectada de nabo o la proteína helper de CaMV (P2-CaMV) en dieta artificial y posteriormente CMV en una planta de calabacín. Por último, se evaluó la interferencia entre Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV, Potyvirus) y CMV usando A. gossypii como vector. Para ello, los pulgones adquirieron individualmente bien ZYMV o CMV en plantas infectadas de melón y después eran transferidos a una planta de melón infectada con CMV o ZYMV, respectivamente. Tras la realización de los experimentos los pulgones fueron transferidos individualmente a diferentes especies de plantas receptoras teniendo en cuenta las especies de virus estudiadas. La infección viral se evaluó mediante inspección visual y mediante detección serológica (test de ELISA) tres semanas después de la realización de los ensayos. Los resultados revelaron que la adquisición previa de ZYMV interfiere en la posterior adquisición de CMV, reduciendo la tasa de transmisión de este último. Sin embargo, no se observó competencia o interferencia en el resto de combinaciones virus-vector estudiadas: competencia/interferencia entre CaMV y TuMV e interferencia entre CaMV y CMV. Estos resultados revelaron la interacción entre los virus CMV y ZYMV durante el proceso de adquisición por el vector, sugiriendo cierta afinidad por los mismos lugares de retención en el estilete. Los resultados obtenidos también sugirieron que los receptores usados por CaMV en los estiletes del vector debieran ser diferentes a los empleados por potyvirus y cucumovirus. En el tercer objetivo (Capítulo 6), se estudió el comportamiento alimenticio de M. persicae en relación a la inoculación y adquisición de Beet yellows virus (BYV, Closterovirus), el cual es un virus transmitido de manera semipersistente y que se encuentra restringido al floema de la planta huésped (Esau, 1968). En primer lugar, se realizaron ensayos utilizando las dos especies de vectores más eficientes en la transmisión de BYV, M. persicae y Aphis fabae (Sylvester, 1956; Bennett, 1960; Limburg et al., 1997), así como tres especies de plantas huésped de BYV: Chenopodium album, Claytonia perfoliata y Beta vulgaris (Sylvester, 1956; Bennett, 1960) para determinar el sistema virus-vector-planta huésped más eficiente. Los resultados mostraron que M. persicae fue el vector más eficaz, y B. vulgaris (remolacha azucarera) la especie de planta más susceptible a la infección por BYV, por lo que se escogió el modelo M. persicae-BYV-remolacha azucarera para la realización de los posteriores estudios monitorizando el comportamiento alimenticio del pulgón mediante EPG. Para ello, se conectaron individuos no virulíferos al equipo de EPG para alimentarse en remolacha azucarera infectada con BYV y se interrumpió el proceso de alimentación de M. persicae tras observar unos patrones específicos de onda. Así, las diferentes actividades del pulgón producidas en la planta fuente de virus eran posteriormente asociadas a la adquisición de BYV. Una vez terminado artificialmente el proceso de alimentación, los pulgones eran transferidos individualmente a una planta sana de remolacha para evaluar la eficacia de transmisión de BYV. Por otra parte, se conectaron pulgones virulíferos al equipo de EPG y se colocaron sobre plantas sanas de remolacha azucarera para estudiar las actividades de los estiletes del pulgón relacionadas con la inoculación de BYV. Las plantas receptoras fueron analizadas visualmente y mediante detección por ELISA para evaluar la infección viral, cuatro semanas después de la realización de los experimentos. El análisis de los registros de EPG reveló la producción de una prueba intracelular que difería significativamente, tanto en la duración total como en la magnitud de caída de potencial, del resto de pruebas intracelulares, realizadas fuera de los tejidos floemáticos y asociadas a la transmisión de virus no persistentes (Martín et al., 1997). Dicha nueva prueba intracelular de características diferentes a las pds estándar se denominó "phloem-pd" o pd de floema, debido a que siempre ocurría precediendo a la onda asociada como primer contacto de los estiletes del pulgón con los vasos cribosos del floema (onda E1), lo que sugería su posible localización en células del floema. Además, la magnitud de caída de potencial de la "phloem-pd" era similar a la observada en la subsiguiente onda E1. Asimismo, la "phloem-pd" resultó ser la onda clave en la inoculación de BYV, obteniéndose el óptimo de inoculación tras su realización. Todo ello sugería que los estiletes de M. persicae se podrían encontrar en células de floema durante la realización de las "phloem-pd". En el cuarto objetivo (Capítulo 7), se llevó a cabo la localización exacta de la posición del extremo distal del estilete de M. persicae durante la realización de una inserción intracelular "phloem-pd" en plantas de remolacha azucarera. Para ello, se llevó a cabo la criofijación del estilete durante la observación de dicho tipo de prueba intracelular, y el posterior estudio de la posición del extremo distal de los estiletes usando tanto la microscopía confocal (CLSM) como la tomografía microcomputerizada (Micro-CT). Asimismo, se llevaron a cabo dos tratamientos control, criofijando los estiletes durante la observación de i) una prueba intracelular estándar ("standard-pd": prueba asociada a penetraciones de los estiletes en tejidos no floemáticos) y ii) onda E1 (inserción de los estiletes en tubos cribosos de floema). El análisis de las imágenes obtenidas por microscopía confocal mostró la localización del extremo distal del estilete penetrando tejidos floemáticos, concretamente células acompañantes y tubos cribosos del floema. Las imágenes producidas por Micro-CT confirmaron la intrusión de los estiletes en tubos cribosos de floema. Los tratamientos control reflejaron la inserción de los estiletes en células del mesófilo o en la vaina del haz vascular durante la realización de la "standard-pd", y penetraciones en tubos cribosos del floema durante la visualización de la onda E1, tal y como se había descrito previamente para ambos tipos de ondas (Tjallingii, 1990; Prado y Tjallingii, 1994). Los resultados obtenidos en la presente Tesis Doctoral podrían tener claras implicaciones en futuras líneas de investigación relacionadas con las interacciones virus-vector-planta así como en el desarrollo de nuevas estrategias innovadoras que permitan interferir con el proceso de transmisión y consiguiente dispersión de los virus vegetales en los cultivos. SUMMARY The main objective of this Thesis was to study several aspects concerning non-circulative plant virus transmission by aphids and generate basic knowledge to develop new strategies to interfere with virus transmission and spread. More precisely, the following specific objectives were covered in the present PhD Thesis: 1. To evaluate the effect of the pre-acquisition fasting period in the transmission of viruses transmitted in a non-persistent manner by aphids. 2. To study the competition and interference of different non-circulative viruses for the retention sites in their aphid's vector. 3. To study the feeding behaviour of aphids associated with the transmission of semipersistently transmitted, phloem-limited viruses. 4. To localize the aphid's stylet tip position in specific plant tissues during the occurrence of key feeding behavioural patterns associated with the transmission of semipersistent phloem-limited viruses The experiments concerning objectives 1, 2 and 3 of this Thesis were developed at Institute of Agricultural Sciences (ICA) facilities of the Spanish National Research Council (CSIC) (Madrid, Spain). Part of the experiments within objective 4 were conducted in a short-term research placement at University of California Riverside (UCR) (Riverside, CA., USA) in collaboration with Prof. James Ng at the Department of Plant Pathology and Prof. Gregory P. Walker at the Department of Entomology. Results of experiments of objective 4 were confirmed by the analysis of leaf and insect samples at the University of Granada (Granada, Spain) in collaboration with Prof. Javier Alba-Tercedor at the Department of Zoology. The Electrical penetration graphs (EPG) technique was used in all the objectives of this PhD Thesis. Using this technique, we could monitor the feeding process of aphids in the plant and determine the position of their stylets tip in specific plant tissues. Therefore, we could determine the different aphid activities in the plant involved in the acquisition and inoculation of NC phloem-limited plant viruses. The first study aimed to evaluate the pre-acquisition fasting effect of Myzus persicae and Aphis gossypii on the transmission of Cucumber mosaic virus (CMV, Cucumovirus) (Chapter 4). Fasted and non-fasted aphids were wired and connected to the EPG device and allowed to produce a single intracellular puncture (waveform ‘pd’: potential drop) as acquisition access period (AAP) in a CMV-infected zucchini plant. To determine if the aphids acquired CMV during the AAP, they were individually transferred to a non-infected test zucchini plant to assess CMV infection by visual inspection and ELISA test three weeks after the experiments. EPG recordings showed an increase of probing activities in fasted aphids favoring the acquisition of non-persistent viruses (Collar and Fereres, 1998). In fact, fasted M. persicae individuals showed an increase in CMV transmission. However, fasted A. gossypii individuals did not increase the transmission rate of CMV compared to non-fasted. Therefore, here we showed that a pre-acquisition fasting period does not always enhance the transmission of all viruses transmitted in a NP manner, as previously postulated for this type of virus-vector relationship (Watson, 1938; Powell, 1993). Results suggested possible anatomical differences in the stylets of M. persicae and A. gossypii individuals or presence of different compounds in the saliva of each aphid species that could favor or interfere with the interaction with CMV particles. The competition or interference for the retention sites in their aphid vectors was also studied for several non-circulative (NC) virus species (Chapter 5). The transmission of different combinations of virus species by their most efficient vectors were studied: i) competition and interference between Cauliflower mosaic virus (CaMV, Caulimovirus) and Turnip mosaic virus (TuMV, Potyvirus) in Brevicoryne brassicae, ii) interference between CaMV and CMV in M. persicae, and iii) interference between Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV, Potyvirus) and CMV in A. gossypii. After virus acquisition on different sources, aphids were individually transferred to different non-infected receptor test plants depending on the virus-vector combination studied. Virus infection was assessed by visual inspection and ELISA test three weeks after the experiments. Results revealed that CaMV did not interfere with the subsequent transmission of either TuMV or CMV. However, the acquisition of ZYMV interfered in subsequent acquisition and transmission of CMV, with no impact in the rate of transmission of ZYMV after first acquisition of CMV. Therefore, we found that potyviruses and cucumoviruses interfered with each other during the acquisition process by their main vector, suggesting that they bind to the same receptors in the stylets. Conversely, CaMV probably binds to receptors different from those used by potyviruses and cucumoviruses. Furthermore, we aimed to investigate the aphid activities involved in the transmission of semipersistently transmitted, phloem-limited viruses, as it is Beet yellows virus (BYV, Closterovirus) (Esau, 1968), using M. persicae as vector. First, we performed preliminary tests using the two most efficient vectors of BYV: M. persicae and Aphis fabae (Sylvester, 1956; Bennett, 1960; Limburg et al., 1997), and three BYV-host plants: Chenopodium album, Claytonia perfoliata and Beta vulgaris (Sylvester, 1956; Bennett, 1960). Our goal was to determine the most efficient vector-virus-plant combination to perform the EPG experiments. Results showed that M. persicae-B. vulgaris was the most efficient combination. Therefore, we monitored the feeding behaviour of M. persicae on B. vulgaris by EPG and terminated the feeding process after the observation of specific EPG patterns to determine which stylet activities were involved in the acquisition and transmission of BYV. In order to determine the aphid stylet activities involved in BYV acquisition, we monitored the feeding process of non-viruliferous M. persicae individuals during an AAP in BYV-infected sugar beets and then individually transferred the aphids to non-infected receptor sugar beets which were assessed for BYV transmission efficiency by visual inspection and ELISA test four weeks later. Development of BYV infection in the receptor plants indicated that the aphids had acquired BYV during the AAP. Additionally, we monitored the feeding process of viruliferous M. persicae in non-infected sugar beet plants to associate the aphid stylet activities involved in BYV inoculation. The analysis of the EPG recordings revealed a new brief intracellular puncture (hereafter called as phloem-pd) that was associated with inoculation of BYV. The highest BYV inoculation rate was observed when feeding was terminated after the observation of the phloem-pd waveform. Phloem-pds significantly differed from the standard intracellular punctures (standard-pds) previously associated with the transmission of non persistent viruses by aphids that occurred in non-vascular plant tissues (Martín et al., 1997). This new distinct pattern had a shorter duration and lower potential drop magnitude than standard-pds. Also, this particular EPG pattern always preceded the E1 phase (continuous salivation into phloem sieve elements). Therefore, we proposed the name phloem-pd due to the likely possibility that this newly distinctive potential drop occurred in phloem cells (phloem parenchyma, companion or sieve element cells). Therefore, we performed studies to localize the exact position of the stylet tip in the phloem tissues during the occurrence of the phloem-pd (Chapter 7). We cryofixed both the aphid and leaf tissue surrounding the aphid stylets during a phloem-pd and then identified the type of cell punctured by the stylets using confocal laser-scanning microscopy (CLSM) and micro-computed tomography (micro-CT). Two control treatments were conducted by cryofixing the stylets during a standard-pd and also during the first E1 phase of the aphid. Images from CLSM showed the stylets punctured companion and sieve element cells during a phloem-pd. Images from samples analyzed by Micro-CT confirmed that aphid stylets penetrated sieve elements during a phloem-pd. Therefore, we demonstrated by using two different microscopic techniques that aphids can briefly penetrate sieve elements and also companion cells during phloem-pds that occur prior to a penetration that results in continuous salivation phase of the aphid in sieve elements (E1 waveform). During the production of a standard-pd, the stylets penetrated mesophyll or bundle sheath cells, whereas during E1, the stylets penetrated sieve element cells, as previously shown for these two reported EPG patterns (Tjallingii, 1990; Prado and Tjallingii, 1994). The present Thesis provides new insights on several aspects concerning the transmission of NC viruses by aphids. In addition, results from the present Thesis will help to develop new strategies to interfere or block the retention and transmission of NC by their insect vectors.