Microextracción con disolventes supramoleculares para la determinación estereoselectiva de contaminantes emergentes quirales

Resumen

1. Introducción o motivación de la tesis Los contaminantes emergentes son sustancias químicas de origen antropogénico recientemente detectadas en el medio ambiente y los alimentos como consecuencia de la incorporación de su uso en la industria, agricultura, ganadería, etc. Un importante número de contaminantes emergentes son quirales, es decir presentan diferentes formas estereoisoméricas (una sustancia química con dos enantiómeros o varios isómeros con dos enantiómeros cada uno de ellos) que generalmente difieren en toxicidad y persistencia en el medio ambiente [1]. Por lo tanto, para realizar una correcta evaluación de los riesgos medioambientales y para la salud humana de estos contaminantes, es fundamental monitorizar cada uno de sus estereoisómeros individualmente, para lo que se debe disponer de métodos analíticos adecuados. Los métodos disponibles para la determinación estereoselectiva de contaminantes emergentes son, en el mejor de los casos, escasos y laboriosos y, en muchas ocasiones inexistentes, por lo que es fundamental desarrollar nuevos métodos analíticos que permitan analizar un elevado número de muestras de forma fiable, simple, rápida y con bajo coste. Esta Tesis ha tenido como objetivo el desarrollo de nuevos métodos para la determinación estereoselectiva de contaminantes emergentes en muestras medioambientales y de alimentos basados en extracción con disolventes supramoleculares (supramolecular solvent, SUPRAS) y cromatografía líquida quiral acoplada a espectrometría de masas (LCQ-MS/MS). Los SUPRAS, líquidos nanoestructurados constituidos por agregados de compuestos anfifílicos [2], presentan características que los hacen especialmente adecuados para su uso en procesos de extracción, entre las que cabe destacar la facilidad para obtener disolventes con diferentes funcionalidades mediante procesos de síntesis muy simples y su elevada eficacia de extracción [2,3]. La LCQ-MS/MS, por su parte, permite separar estereoisómeros e identificar y cuantificar estos compuestos de forma selectiva. 2. Contenido de la investigación Las investigaciones realizadas han permitido desarrollar métodos para la determinación de estereoisómeros de contaminantes emergentes en muestras medioambientales y productos agrícolas. Análisis quiral de muestras medioambientales. Dentro de este contexto se ha evaluado la capacidad de disolventes supramoleculares constituidos por agregados hexagonales inversos de ácido decanoico (ADe) para extraer contaminantes halogenados mediante la formación de enlaces de halógeno, un tipo de enlace muy fuerte y direccional, en distintos tipos de muestras medioambientales [aguas naturales (fracción líquida y partículada), suelos, sedimentos y peces]. Los contaminantes halogenados estudiados han sido los estereoisómeros del hexabromociclododecano (HBCD), enantiómeros (+) y (-) de los isómeros α-, β- y γ-HBCD. Estos compuestos forman parte de un aditivo industrial ampliamente usado como retardante de llama desde la prohibición en la Unión Europea en 2006 del uso de los bisfenilos y difenil éteres polibrominados. Los SUPRAS de ADe se sintetizaron adicionando H2O a pH ácido (1-4) a suspensiones coloidales de micelas inversas del anfifilo en tetrahidrofurano (THF). Las proporciones de THF y H2O usadas en la síntesis determinan la nanoestructura y composición del disolvente y, por tanto, su capacidad de extracción. Por otra parte, la nanoestructura del disolvente también determina su capacidad para actuar como material de acceso restringido, es decir, su capacidad para excluir macromoléculas presentes en las muestras (ácidos húmicos, polisacáridos, proteínas), proporcionando extractos que pueden ser directamente inyectados en el cromatógrafo de líquidos sin necesidad de realizar etapas adicionales de limpieza. Una vez seleccionado el disolvente supramolecular usado para la extracción se estudió la influencia de diferentes variables experimentales en la eficacia de la extracción. En los estudios realizados sobre extracción de HBCD en suelos y sedimentos también se investigó el efecto en la eficacia de extracción obtenida del tiempo de contacto del contaminante con las partículas de suelo y sedimento y, en las investigaciones realizadas para desarrollar un método para la determinación de HBCD en la fracción líquida y particulada de aguas naturales, se estudió la viabilidad de los procedimientos propuestos hasta el momento basados en filtración para separar ambas fracciones y se desarrolló un método alternativo de separación basado en centrifugación. En cuanto a la determinación estereoselectiva del HBCD, se demostró que el uso de disolventes de ADe era compatible con la separación de los estereoisómeros del HBCD en una fase estacionaria de β-ciclodextrina y su detección mediante espectrometría de masas en tándem con su ionización en una fuente de electroespray en modo negativo. Para cada una de las muestras investigadas, se determinó el método de calibración más adecuado para corregir los efectos matriz y se establecieron los parámetros de calidad del método desarrollado basado en extracción supramolecular y LCQ-MS/MS. Finalmente, los métodos propuestos se usaron para determinar los estereoisómeros del HBCD en una amplia variedad de muestras medioambientales líquidas y sólidas a concentraciones del orden de los ng L-1 y ng g-1, respectivamente. Análisis quiral de productos agrícolas. Las investigaciones se han centrado en el desarrollo del primer método estereoselectivo para la determinación de residuos de insecticidas del grupo de los piretroides en frutas y verduras. Los piretroides sintéticos comenzaron a usarse como insecticidas en los años 50, pero ha sido recientemente cuando se ha extendido su uso debido a las restricciones impuestas a la utilización en agricultura de otros insecticidas, como los plaguicidas organoclorados. Los estudios se han centrado en la permetrina, un piretroide sintético de primera generación ampliamente usado fuera de Europa para proteger cultivos de frutas y verduras de las plagas de insectos. En Europa su uso está prohibido debido a su toxicidad, pero se encuentra con frecuencia en productos importados. El método desarrollado permite determinar los cuatro estereoisómeros de la permetrina, los enantiómeros S y R de los isómeros cis y trans, mediante su extracción con un disolvente supramolecular volátil constituido por agregados hexagonales inversos de hexanol y la inyección de los extractos en el cromatógrafo de líquidos una vez eliminado el disolvente supramolecular y redisueltos los analitos en metanol. El carácter volátil del disolvente permite compatibilizar la extracción de los analitos en un disolvente supramolecular con su determinación estereoselectiva mediante cromatografía líquida quiral acoplada a espectrometría de masas en tándem. Los estudios realizados para desarrollar este método incluyen el establecimiento de las condiciones experimentales para la separación de los cuatro estereoisómeros de la permetrina en una fase estacionaria de β-ciclodextrina y su detección mediante espectrometría de masas usando una fuente de electroespray para su ionización en modo positivo como aductos de amonio. También se investigó la compatibilidad de diferentes disolventes supramoleculares constituidos por agregados hexagonales inversos de alcanoles con longitud de cadena comprendida entre 6 y 12 átomos de carbono con la determinación cromatográfica de los analitos. Estos disolventes se sintetizaron disolviendo el alcanol en THF y adicionando agua. Una vez seleccionado el disolvente de hexanol como extractante, se optimizó el proceso de extracción estudiando el efecto de diferentes variables experimentales en la eficacia de extracción y en la limpieza de los extractos, realizando estudios para evaluar el efecto matriz en distintos tipos de frutas (manzana, naranja y melón) y verduras (pimiento verde, tomate, judías verdes y col) y seleccionar el método de calibración más adecuado en cada caso. El método desarrollado para determinar los estereoisómeros de la permetrina en frutas y verduras se caracterizó evaluando sus propiedades analíticas y se aplicó al análisis de muestras adicionadas con concentraciones de (R)-cis-, (S)-cis-, (R)-trans- y (S)-trans-permetrina del orden de los ng g-1. 3. Conclusión Las investigaciones realizadas permiten concluir que la combinación de microextracción con disolventes supramoleculares (SUPRAS) y cromatografía líquida quiral acoplada a espectrometría de masas en tándem (CLQ-MS/MS) es una estrategia adecuada para desarrollar métodos simples y rápidos para la determinación de estereoisómeros de contaminantes quirales en muestras medioambientales y de alimentos. Los SUPRAS investigados, constituidos por agregados inversos de ácido decanoico o hexanol, proporcionan extracciones cuantitativas para los analitos estudiados usando bajas relaciones de volumen de SUPRAS a volumen de muestra líquida o peso de muestra sólida (1,4 µL mL‒1, 0,4-0,8 µL mg‒1) y bajos tiempos de extracción (5-15 min). Además, proporcionan extractos lo suficientemente limpios para ser analizados directamente mediante CLQ-MS/MS, sin necesidad de realizar etapas adicionales de limpieza, necesarias cuando se utilizan disolventes orgánicos como extractantes. Las excelentes prestaciones de los SUPRAS en procesos de microextracción se pueden explicar teniendo en cuenta: 1) Su elevada capacidad de solubilización debido al elevado número de centros de solubilización disponibles en los agregados de anfifilo que constituyen el disolvente y a la capacidad de las moléculas de anfifilo para establecer enlaces intermoleculares con los analitos mediante distintos tipos de interacciones que actúan de forma cooperativa. El anfifilo usado en la síntesis determina el tipo de interacciones que se establecen con el analito en el disolvente (ej. enlaces de halógeno usando SUPRAS de ácido decanoico para extraer contaminantes halogenados). 2) Su elevada área superficial debido a su carácter discontinuo, al estar constituidos por gotas de coacervado, lo que facilita la transferencia de los analitos de la muestra al SUPRAS reduciendo los tiempos de extracción. 3) Su comportamiento como materiales de acceso restringido, lo que permite la extracción de moléculas de pequeño tamaño (analitos) sin que se produzca la extracción de macromoléculas presentes en las muestras (ej. proteínas, polisacáridos, ácidos húmicos, etc.), proporcionando de este modo extractos más limpios que los obtenidos usando disolventes orgánicos como extractantes. Por otra parte, la composición (concentración de anfifilo, THF y H2O) y nanoestructura de los SUPRAS no afectan a la eficacia de la extracción obtenida para ninguna de las matrices investigadas, lo que permite desarrollar métodos de extracción muy robustos. Los extractos más limpios se obtienen usando disolventes con una elevada concentración de anfifilo y bajo contenido en THF y H2O, es decir aquellos sintetizados usando un bajo porcentaje de THF [5 % (v/v) y 1 % (v/v) para SUPRAS de ácido decanoico y hexanol, respectivamente]. Estos disolventes son los que presentan una mayor capacidad para actuar como materiales de acceso restringido al poseer una nanoestructura con un mayor grado de empaquetamiento de las moléculas de anfifilo y menor tamaño de las cavidades acuosas de los agregados hexagonales inversos. Finalmente, es importante destacar que el uso de SUPRAS de agregados inversos de ácido decanoico o hexanol permite desarrollar procedimientos de microextracción de bajo coste, seguros para los analistas y respetuosos con el medio ambiente al reducir drásticamente el volumen de disolvente usado para la extracción y la cantidad de residuos químicos generados respecto a los métodos basados en el uso de disolventes orgánicos. 4. Bibliografía [1] C.S. Wong, Anal. Bioanal. Chem. 386 (2006) 544. [2] A. Ballesteros-Gómez, M.D. Sicilia, S. Rubio, Anal. Chim. Acta 677 (2010) 108. [3] C. Caballo, M. D. Sicilia, S. Rubio. Suparamolecular solvents for Green Chemistry En “The application of green solvent in separation processes”. Elsevier (2017) 111-137. Publicaciones derivadas de esta Tesis 1. Enantiomer-specific determination of hexabromocyclododecane in fish by supramolecular solvent-based single-step sample treatment and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. A. B. Lara, C. Caballo, M.D. Sicilia, S. Rubio. Analytica Chimica Acta 752 (2012) 62-68. 2. Speeding up the extraction of hexabromocyclododecane enantiomers in soils and sediments based on halogen bonding. A. B. Lara, C. Caballo, M.D. Sicilia, S. Rubio. Analytica Chimica Acta 1027 (2018) 47-56. 3. Halogen bonding for increasing efficiency in liquid-liquid microextraction: Application to the extraction of hexabromocyclododecane enantiomers in river waters. A. B. Lara, C. Caballo, M.D. Sicilia, S. Rubio. Journal of Chromatography A 1600 (2019) 95-104. 4. Quick and sensitive enantioselective determination of permethrin in fruits and vegetables by combining supramolecular solvents and chiral liquid chromatography-tandem mass spectrometry. A. B. Lara, C. Caballo, M.D. Sicilia, S. Rubio. Journal of Agricultural and Food Chemistry (2020) enviado para su publicación.