Analisis mediante rt-pcr de la enzima tirosinasa en sangre periferica de pacientes con melanoma. Prueba para la evaluacion de la progresion de la enfermedad

Resumen

El interés de nuestra investigación se ha centrado en la detección en sangre periférica de la enzima tirosinasa mediante la Reacción de la Transcriptasa Inversa y Reacción en Cadena de la Polimerasa en 58 pacientes diagnosticados con melanoma cutáneo. Para ello hemos utilizado diferentes técnicas: - Selección de los primeros para amplificar la enzima tirosinasa se llevó a cabo mediante el programa OIGO 1000 DNA. - Las muestras procesadas fueron: ganglios linfáticos de pacientes con MC de estadio III, como controles positivos, muestras de sangre sin evidencia de enfermedad, como controles negativos y muestras de sangre de pacientes diagnosticados de melanoma en diferentes estadios. - El procesamiento de extracción de ARN de muestras de sangre, se utilizaron dos procedimientos: el primero basado en la obtención de ARN a partir de monocitos y en el segundo a partir de linfocitos. - Para cuantificar la cantidad de ARN se utilizó un espectrofotómetro de ultravioleta a una densidad óptica entre 260nm y 280nm. El chequeo del ARN se realizó mediante electrofóresis en un mini gel de agarosa al 1%. - La síntesis de ADNc se realizó mediante transcriptasa reversa. - La PCR se realizó con primers para la * * * actina que fue usada como control y primers específico para el gen de la tirosinasa. La visualización se realizó mediante electrofóresis. - Por último realizamos el análisis estadístico mediante el programa informático de epidemiología SPSS (versión 8.0). Los resultados obtenidos han sido los siguientes: - Los primers M1 y M2 correspondientes a los exones 1 y 3 del gen de la tirosinasa son los más específicos para la detección de células de melanoma en sangre periférica con una Tm de 55grados C. - La extracción de ARN a partir de un pellet de linfocitos de muestras de sangre se presenta como el mejor procedimiento para la amplificación mediante PCR del ADNc de la tirosinas