Aplicación de la tecnología de las barreras en el desarrollo de as-48 como bioconservante alimentario. Estudio de probiosis de una cepa productora de as-48

Resumen

La enterocina AS-48 es un péptido antimicrobiano producido por cepas del género Enterococcus (Gálvez et al., 1986). Consta de 70 aminoácidos no modificados y una masa molecular de 7.149,25. Lo singular de esta molécula es su naturaleza circular, establecida a través de un enlace peptídico que une los extremos amino y carboxilo y cierra la estructura (Samyn et al., 1994; Martínez Bueno et al., 1994). En su composición aminoacídica destaca una alta proporción de aminoácidos básicos, lisina y arginina, lo que justifica su carácter fuertemente catiónico. Además, contiene una gran cantidad de residuos hidrofóbicos y de aminoácidos hidrofílicos sin carga neta (Gálvez et al., 1989a). La disposición espacial de ambos tipos de aminoácidos en zonas de la molécula bien diferenciadas confiere a la molécula un carácter anfipático muy importante para su actividad biológica, cuya diana es la membrana citoplásmica bacteriana (Langdon et al., 1998; González et al., 2000; Gálvez et al., 1991). Es su estructura circular, lo que sin duda le confiere una gran estabilidad térmica, a pHs extremos y a altas concentraciones de agentes desnaturalizantes. AS-48 presenta actividad bactericida sobre la mayoría de las bacterias Gram-positivas ensayadas (Gálvez et al., 1989b). Dentro de este amplio espectro de acción, es interesante destacar la sensibilidad de bacterias patógenas transmitidas por los alimentos y/o alterantes de los mismos y la falta de actividad sobre células eucariotas (Gálvez et al., 1989b). Dadas sus propiedades de espectro de acción y resistencia a agentes físicos y químicos, desde hace algunos años se viene ensayando esta enterocina en alimentos, como alternativa a los conservantes químicos tradicionales, para aumentar la seguridad higiénica y la vida media de diversos productos alimentarios. La aplicación de AS-48 en alimentos se ha realizado mediante producción in situ y ex situ de la misma, en diversos tipos de alimentos, lácteos, cárnicos y vegetales. Aunque los resultados fueron muy prometedores, las cantidades de AS-48 necesarias para inhibir a patógenos fueron muy superiores a las establecidas previamente en medios de cultivo de laboratorio (Mendoza et al., 1999; Muñoz et al., 2004; 2007; Ananou et al., 2004; Ananou et al., 2005a, 2005b). Las causas de este hecho, que ha sido referido para la mayor parte de las bacteriocinas, son varias: condiciones de procesado del alimento, inestabilidad de la bacteriocina a los cambios de pH del alimento, inactivación por enzimas, interacción con aditivos/ingredientes, adsorción a componentes del alimento, baja solubilidad y distribución irregular en la matriz alimentaria. Estos factores son tanto más importantes en limitar la eficacia de las bacteriocinas en alimentos cuanto mayor es la complejidad de la matriz alimentaria. En consecuencia, se hace evidente la necesidad de validar la efectividad específica de cada bacteriocina, y sus combinaciones con otros agentes antimicrobianos, en cada alimento y frente a cada organismo diana. Por ello, para rebajar la dosis efectiva de AS-48 se planteó el ensayo de su actividad en alimentos, sola y combinada con otras barreras que puedan potenciar su actividad. Para este estudio, sobre todo se han seleccionado derivados cárnicos (pescados incluidos), ya que son muy propensos a contaminarse y vehiculizar bacterias patógenas, que se han suplementado con AS-48, sola y combinada con compuestos químicos de grado alimentario así como con barreras físicas implementadas en la conservación de alimentos. Uno de los modelos alimentarios ha sido el jamón cocido. Según los resultados obtenidos podemos concluir que puede usarse AS-48, sola o combinada con barreras químicas o físicas en la prevención de la contaminación de este alimento por bacterias patógenas como Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus y en la alteración debida a Lactobacillus sakei, Brochothrix thermosphacta, o Staphylococcus carnosus. Aunque la enterocina por sí sola es efectiva, la combinación de AS-48 con otras barreras, como tripolifosfatos, pirofosfato sódico, nitritos/nitratos, lactato sódico o acetato sódico (en el caso de los organismos alterantes) puede aumentar su actividad inhibidora, reduciendo la concentración efectiva y proporcionando protección en productos con un nivel de contaminación más elevado. El envasado a vacío ha mostrado ser particularmente efectivo en aumentar la actividad de AS-48 frente a Lb. sakei y B. thermosphacta. AS-48 se ha aplicado sola o en combinación con el conservante natural Proallium DMC®, un aromatizante basado en extractos de Aliáceas incorporados en dextrinas, con propiedades antibacterianas bien demostradas. Los resultados obtenidos, aplicando la enterocina AS-48, sola y sobre todo combinada con el extracto aliáceo en diversos tipos de alimentos cárnicos procesados (hamburguesas, chistorras, albóndigas y jamón cocido) frente a L. monocytogenes, S. aureus y Clostrdium perfringens son muy alentadores, expandiendo el abanico de posibilidades del uso de la enterocina en aquellos productos donde sea compatible el uso de Proallium cuyo afecto antimicrobiano se suma al de AS-48. También se ha ensayado la eficacia de la enterocina tras ser incorporada en cuatro tipos de recubrimientos comestibles (RC) basados en ésteres de sacarosa y ácidos grasos (sucroésteres), ésteres del ácido acético y mono y digliceridos (ACETEM), quitosano y gelatina de pescado. Los alimentos estudiados han sido melón, jamón cocido, queso fresco y merluza fresca, aplicando en cada tipo de alimento el RC más adecuado a su naturaleza y estudiando la influencia de la implementación del RC adicionado de AS-48 sobre la contaminación por las bacterias patógenas (L. monocytogenes en melón y queso) y alterantes (Lb. acidipiscis y S. carnosus, en merluza fresca; Lb. sakei y B. thermosphacta en jamón cocido) seleccionadas. Se ha concluido que la incorporación de AS-48, a cualquiera de los recubrimientos comestibles utilizados, es una estrategia muy válida para la aplicación efectiva de la enterocina en diversos tipos de alimentos, permitiendo el control de bacterias alterantes y patógenas vehiculizadas por los mismos. En pescado fresco (merluza y salmón) y ahumado (salmón) se ha ensayado la aplicación de tratamientos combinados de AS-48 con el fago lítico de L. monocytogenes P-100, así como de ambos agentes por separado para controlar a este patógeno. Los resultados de este estudio indican la capacidad de tanto la enterocina AS-48 como del fago P100 para controlar L. monocytogenes en pescado crudo y ahumado. Aunque las dosis no son comparables (hay que tener en cuenta el efecto amplificador del ciclo lítico del fago), AS-48 parece ser más efectiva que el fago. Los mejores resultados se consiguieron por la aplicación simultánea de ambos agentes biológicos, que consiguió eliminar a las listerias en ambos tipos de pescado crudo. De los estudios de toxicidad subcrónica de la enterocina, llevados a cabo mediante la administración oral continuada de la misma a ratones BALB/c, a una concentración máxima de 200 mg/kg durante 90 días, se puede concluir que AS-48 no produce efectos adversos sobre ninguno de los parámetros evaluados, por lo que es factible su uso como conservante alimentario. La cepa E. faecalis UGRA10, aislada de un queso artesanal de leche de cabra y buena productora de la enterocina AS-48, ha sido estudiada en relación a su potencial uso como probiótico, dada la importancia que se da a la producción de antimicrobianos en ciertos beneficios para el hospedador. Debido al carácter de patógenos oportunistas de algunas cepas de enterococos, se ha hecho especial énfasis en estudiar la bioseguridad de UGRA10. De los estudios previos realizados in vitro cabe destacar la capacidad para hidrolizar caseína y producir enzimas lipasa, cualidades de interés tecnológico. La cepa presenta los genes gelE, asa1, esp, efa y ace que codifican para putativos factores de virulencia en enterococos aunque más que verdaderos genes de virulencia, pueden ser considerados como factores de colonización y de permanencia en el tracto gastrointestinal. Las resistencias a antibióticos detectadas en UGRA10 son intrínsecas a la especie y por tanto no transmisibles. En cuanto a su habilidad para sobrevivir a las condiciones del tracto gastrointestinal e implantarse en él, resiste bien el pH ácido, forma biofilmes y tiene una moderada capacidad de adhesión a la línea celular Caco-2, derivada de adenocarcinoma de colon humano. Muy interesante es la interferencia con la adhesión de L. monocytogenes a células Caco-2, efectuada por UGRA10, cuando ésta es adicionada antes o conjuntamente con el patógeno.