Mecanismos de regresión y activación testicular en mamíferos con reproducción estacionalcontrol genético y susceptibilidad a cambios ambientales

Resumen

RESUMEN La reproducción estacional es la que se produce de forma discontinua a lo largo del año como resultado de la adaptación a las fluctuaciones ambientales resultante de las estaciones climáticas. Este comportamiento lo presentan numerosas especies de vertebrados que habitan en regiones templadas de la Tierra, concentrando así su esfuerzo reproductivo en aquellas estaciones del año que ofrecen mejores condiciones ambientales y garantizando que la descendencia nazca y crezca en los periodos más favorables. Las especies con reproducción estacional son capaces de detener y reanudar la gametogénesis de forma cíclica. Tanto los machos como las hembras experimentan cambios sustanciales en sus gónadas durante la transición entre los períodos reproductivos y no reproductivos. En los machos tiene lugar un proceso de regresión testicular que implica cambios importantes en la función testicular, viéndose alteradas la espermatogénesis, la androgénesis y el sistema inmunológico local. La mayor parte de los estudios realizados hasta el momento son incompletos pues sólo enfocan aspectos muy particulares de proceso en muchos casos (apoptosis, variaciones hormonales, ultraestructura, cambios morfológicos, dinámica de las moléculas de adhesión celular). Estudios completos que incluyan todas estas características sólo se han llevado a cabo en un número reducido de especies, como el topo ibérico, el armadillo de pelo largo y topillo mediterráno. En la presente tesis doctoral, hemos realizado un estudio completo del proceso de regresión testicular en una nueva especie, el erizo orejudo, Hemiechinus auritus con individuos procedentes del norte de Egipto. Nuestros resultados muestran que en esta especie el principal efector de regresión testicular es la descamación de las células germinales, como se ha descrito previamente tanto en el topo ibérico Talpa occidentalis como en el gran armadillo peludo C. villosus. La presencia de abundantes espermatocitos primarios en el lumen, tanto de los túbulos seminíferos como de los epidídimos, indica que las células meióticas inmaduras se desprenden precozmente del epitelio seminífero. Posteriormente, estas células germinales que se han desprendido son eliminadas a través de la sección distal del tracto genito-urinario. Además encontramos que la apoptosis no es la causa principal de la pérdida de células germinales en el testículo en regresión de H. auritus, ya que hay un número muy reducido de células apoptóticas en dichos testículos. Sin embargo, la apoptosis sí juega un papel importante en los testículos inactivos, ya que es el principal mecanismo que elimina los espermatocitos primarios que alcanzan el estadio de paquitene. Por otro lado, hemos encontrado que la expresión de moléculas de adhesión celular está alterada tanto en el epitelio germinativo de los testículos en regresión como los inactivos, sugiriendo que la adhesión entre células de Sertoli y entre las células de Sertoli y las células germinales está comprometida en los testículos en regresión, explicando así el desprendimiento de células germinales que tiene lugar durante este periodo. Finalmente, al igual que ocurre en todas las especies estudiadas hasta la fecha, los niveles de testosterona circulantes están reducidos en los individuos inactivos de H. auritus, indicando que la reducción de la concentración de andrógenos es probablemente la señal hormonal que induce la eliminación estacional de las células germinales y la pérdida de la adhesión celular en el epitelio germinativo de mamíferos. A partir de los diferentes trabajos realizados en mamíferos, como el realizado en la presente tesis doctoral, en los que se estudian los cambios que los testículos sufren durante su ciclo reproductivo anual se extrae la conclusión de que es evidente que no existe un mecanismo único de regresión testicular. Actualmente se han identificado dos procesos celulares principales por los que se eliminan masivamente las células germinales durante el proceso de regresión testicular: la apoptosis y la descamación de células germinales. A pesar de ello, el control genético de estos cambios testiculares es poco conocido, principalmente por la complejidad de las rutas genéticas que operan en un tipo celular específico de testículo y la señalización cruzada entre los diferentes tipos celulares. En este sentido, los estudios de perfiles de expresión pueden proporcionar una visión integrada de las rutas moleculares interactivas que operan en el testículo, y también pueden darnos información sobre cuáles de ellas están afectadas en los testículos con regresión. En la presente tesis doctoral hemos analizado el transcriptoma testicular de dos especies para las que previamente habíamos realizado un estudio histológico, inmunohistológico, funcional y hormonal de los cambios testiculares a lo largo de su ciclo reproductivo, el topillo mediterráneo, Microtus duodecimcostatus y el topo ibérico Talpa occidentalis. Para M. duodecimcostatus hemos encontrado que las rutas de señalización MAPK/ERK1/2, WNT, TGF-Beta, Ca2+ citosólico y PI3K están desreguladas en el testículo inactivo. Todas estas rutas operan en las células de Sertoli y están implicadas en la regulación de la espermatogénesis y en la dinámica de las uniones estrechas y adherentes presentes en la barrera hemato-testicular (BTB). Nuestro análisis demostró que MAPK/ERK1/2, una ruta de señalización necesaria para la proliferación celular mitótica y meiótica, desempeña un papel central en este proceso. Estudios anteriores han demostrado que la testosterona modula la actividad de la ruta de señalización MAPK/ERK en las células de Sertoli, indicando que la disminución de los niveles séricos de testosterona en los machos inactivos de M. duodecimcostatus afecta a la regulación por parte de las células de Sertoli de varias rutas moleculares interconectadas que inducen: a) alteraciones del ciclo espermatogénico, b) desregulación de las moléculas de adhesión célular y c) alteración de la dinámica de la BTB. El testículo está sometido a un entorno inmunológico especial conocido como “inmuno-privilegio” que protege a las células germinales de un ataque autoinmune. Este “inmuno-privilegio” se basa en: a) la formación de la BTB en el epitelio germinativo, b) la capacidad disminuida de la población de macrófagos testiculares para inducir una respuesta inflamatoria y c) la expresión constitutiva de citoquinas antiinflamatorias por parte de las células inmunitarias y otras células somáticas. Nuestro análisis transcriptómico indicó que la población de macrófagos estaba activada en el testículo inactivo de M. duodecimcostatus. Estudios previos han mostrado que la testosterona es esencial para mantener el “inmuno-privilegio” testicular en condiciones fisiológicas, por lo que podemos concluir que los niveles reducidos de testosterona en los testículos inactivos de M. duodecimcostatus pueden inducir la secreción de citoquinas pro-inflamatorias por parte de los macrófagos y, probablemente, por otros tipos de células somáticas (por ejemplo, Sertoli y células mioides peritubulares) que activan a los macrófagos. Resulta interesante que el estudio transcriptómico de los testículos de T. occidentalis también reveló que procesos biológicos como la adhesión celular y el ensamblaje de las uniones celulares, así como varias rutas moleculares, incluyendo MAPK, ERK1/2, TGF-Beta, Ca2+ citosólico, PI3K, GTPasa y TNF estaban alteradas en los testículos inactivos. Por otro lado, el análisis transcriptómico también reveló que el sistema inmunitario se activaba en los testículos inactivos de T. occidentalis. Teniendo en cuenta todas estas observaciones, sugerimos que, como ocurre en M. duodecimcostatus, los bajos niveles de testosterona en los testículos inactivos de T. occidentalis conducen a la pérdida del “inmuno-privilegio” del testículo activo, hecho que se manifiesta por la permeabilidad de la BTB y el aumento de la producción de citoquinas por parte de la población de macrófagos (y quizás de otras células somáticas). En conjunto, todos estos procesos podrían contribuir a mantener el estado de quiescencia de las gónadas de los topos durante el periodo no reproductivo. En T. occidentalis también analizamos los niveles de expresión de genes pertenecientes a la “firma de expresión génica” de grupos espermatogénicos tempranos y descubrimos que varios procesos biológicos están alterados en los testículos inactivos del topo ibérico, en particular la ubiquitinación de proteínas en la etapa de espermatogonia. Sin embargo, es difícil saber si esta alteración en los perfiles de expresión se debe al entorno testicular de los testículos quiescentes, en el que tanto la BTB como la función de adhesión celular están comprometidos, o a mecanismos actualmente desconocidos que afectan directamente a la expresión de las células germinales, o a ambos. Por último, hemos comparado los datos de los tanscriptomas del topo con los del topillo mediterráneo. Encontramos un gran número de genes que están desregulados en los testículos inactivos de ambas especies, con dos coincidencias notables: 1) muchos de estos genes están implicados en el control de la adhesión celular y, de acuerdo con esto, se desregulan rutas moleculares como MAPK, ERK1/2, TGF-Beta, GTPasa y TNF, que controlan las uniones celulares en el epitelio germinativo y 2) también encontramos un conjunto compartido de genes implicados en la regulación de la respuesta inmune. Estas coincidencias son relevantes si tenemos en cuenta que los testículos inactivos de estas dos especies no presentan características idénticas. Por ejemplo, la iniciación de la meiosis por parte de las espermatogonias está completamente abolida en los testículos inactivos de M. duodecimcostatus, pero no en los de T. occidentalis, donde las células germinales entran en meiosis y la espermatogénesis progresa hasta los primeros estadíos de espermatocitos primarios. Además, los túbulos seminíferos inactivos de M. duodecimcostatus permanecen adyacentes entre sí, mientras que los de T. occidentalis se separan ampliamente por la interposición de las células de Leydig. A pesar de estas diferencias, aquí hemos encontrado que dos importantes funciones testiculares, la adhesión celular y la respuesta inmune, están desreguladas en los testículos inactivos de estas dos especies, lo que sugiere que existen mecanismos moleculares conservados asociados a la involución testicular estacional en los mamíferos. Por lo tanto, deberían realizarse estudios similares en otras especies para comprobar esta hipótesis.