Nuevos fluoróforos con aplicaciones en biodetección y bioimagenmedidas del ph celular mediante microscopía flim

Resumen

El pH es un parámetro celular regulado de forma eficaz, por lo que la variación de este es sinónimo de una alteración del correcto funcionamiento de la célula. De ahí la importancia de disponer de procedimientos adecuados para medir este parámetro, puesto que es un importante biomarcador usado en diferentes campos de la investigación biomédica como la Neurociencia, Bioenergética o estudios relacionados con enfermedades como el cáncer. Uno de los métodos más habituales para determinar el pH celular consiste en el uso de biosensores cuya intensidad de fluorescencia varía en función del pH. Para dichas medidas se ha venido usando, generalmente, la microscopía de fluorescencia convencional, no obstante, en los últimos años se está extendiendo el uso de la microscopía FLIM, puesto que como se ha comentado con anterioridad esta técnica ofrece importantes ventajas sobre la microscopía de fluorescencia convencional. La presente tesis doctoral tiene como objeto el estudio de la posible aplicación de una serie de compuestos como biosensores para medidas de pH celular, empleando la microscopía FLIM. La selección de dichos compuestos se ha hecho en base a sus características luminiscentes y a la existencia de grupos ionizables sensibles al pH del medio. Los compuestos seleccionados para este estudio son dos derivados de 1,3,5 tri(estiril)benzeno (TEB-1 y TEB-2), dos derivados de naftaleno (MG y BG), un derivado de perileno diimida (PDI-1) y tres nanopartículas funcionalizadas cuyo núcleo es un quantum dot de CdSe/ZnS. Para ello: se han caracterizado las propiedades fotofísicas de dichos compuestos; se ha estudiado la dependencia entre la fluorescencia y el pH en medios de distinta composición y complejidad; se ha evaluado el efecto de dichos compuestos sobre la viabilidad celular y su capacidad de internalización y distribución por ella; finalmente, se ha medido de forma cuantitativa el pH intracelular de una línea celular normal (C3H/10T1/2) y otra tumoral (SK-MEL-2), empleando para ello la microscopía de fluorescencia resuelta en el tiempo (FLIM). El uso de estos compuestos y la microscopía FLIM para determinar el pH celular puede tener importantes utilidades en numerosos campos de investigación como, por ejemplo: (i) en el campo de la Biología, en el estudio de importantes rutas moleculares, ya que es de gran interés estudiar si la modificación del pH es una causa o un efecto de la misma; (ii) Fisiología celular, pudiéndose emplear para caracterizar el pH fisiológico de diferentes líneas celulares y de esta manera estudiar posibles perturbaciones que ocurren en estas células (alteración del metabolismo, la apoptosis o la división celular); (iii) Farmacología, para estudiar el efecto de ciertos fármacos sobre el pH de las células y si los procesos de resistencias a fármacos radican en una modificación de este pH; (iv) en la investigación del Cáncer, para estudiar las diferencias de pH entre células tumorales y células normales; (v) en el campo de la Neurociencia, concretamente en el estudio del Alzheimer, para estudiar cómo en células neuronales las alteraciones de ciertos genes producen, entre otros efectos, la acidificación del medio y, finalmente, la apoptosis o muerte celular programada, causante de los efectos de esta enfermedad. Las conclusiones que pueden destacarse de cada una de las familias objeto de estudio, han sido las siguientes: TEB-1 y TEB-2, poseen unas propiedades fotofísicas (altos rendimientos cuánticos y largos tiempos de vida de fluorescencia) adecuadas para su posible uso como biosensor. Sin embargo, la emisión de estos compuestos en la región del azul del espectro visible a priori puede ser un inconveniente para dicho uso. No obstante, empleando la microscopía FLIM, gracias a su método de medida, se podría solventar. También se ha comprobado como en ambos compuestos, tanto la intensidad como el tiempo de vida de fluorescencia (τm) varía en función del pH del medio debido a dos procesos físicos: agregación cofacial, predominantemente en TEB-1, y efecto PET, predominantemente en TEB 2. Ambos procesos están gobernados por el estado de protonación de los grupos amina presentes en las cadenas laterales, así como la longitud de estas. Para TEB 2 se ha observado una dependencia lineal de τm con respecto al pH en la región del pH fisiológico, lo cual es interesante de cara ser utilizado para medir el pH celular. En este sentido, se ha comprobado como TEB-2 no presenta ningún efecto significativo sobre la viabilidad celular y, además, penetra y se distribuye de forma adecuada en las células. PDI presenta propiedades fotofísicas adecuadas para su uso en muestras biológicas, como son: un alto rendimiento cuántico, notables tiempos de vida y emisión en la región del verde hasta el rojo del espectro electromagnético. Las variaciones en la fluorescencia de dicho compuesto con el pH del medio son debidas a la agregación cofacial y al efecto PET. Se ha comprobado cómo, tanto en un tampón normal, como en uno que mimetiza el medio intracelular (SIB), dicha fluorescencia presenta una dependencia lineal con el pH en un intervalo que engloba al pH fisiológico, lo que hace posible su uso como biosensor de pH para células. Además, se ha demostrado como PDI-1 no presenta una toxicidad celular aparente en el rango de concentraciones estudiadas y, se internaliza y se distribuye eficazmente por la célula. MG y BG, presentan: bajo rendimiento cuántico, tiempos de vida cortos y emisión en la zona del azul; por lo cual no son los compuestos más idóneos para emplearse en muestras biológicas. Se ha observado que la fluorescencia de estos compuestos es sensible al pH, gracias a un proceso de transferencia de carga (ICT) desde los grupos guanidina hacia el núcleo aromático. En el caso de BG, además, interviene un proceso de trasferencia de protón en estado excitado (ESPT). Sin embargo, el pKa de estos compuestos es muy elevado, lo que incapacitaría su uso para determinar el pH celular. No obstante, estos compuestos podrían ser empleados como sensores de pH ratiométricos empleando técnicas espectroscópicas. QD-DPA, QD-DPAGlu y QD-DPALys, presentan altos rendimientos cuánticos y largos tiempos de vida, además de emisión en la zona del rojo del espectro visible. Todas estas propiedades, junto con la facilidad para penetrar en la célula y su bajo efecto hace a estos compuestos unos buenos candidatos para ser empleados como biosensores en células. La fluorescencia de estos compuestos también se ve influida por el pH del medio, en este caso, debido al estado de protonación de los grupos carboxilo y amina presentes en las cadenas laterales. Se ha demostrado que la dependencia de τm con el pH varía en función de la composición y complejidad del medio. En este sentido, QD DPA es el único que presenta una dependencia lineal con el pH en un intervalo más amplio y que engloba al pH fisiológico. También se observó que la respuesta de QD DPA variaba dependiendo de la línea celular empleada, lo que indica la necesidad de realizar un estudio previo de la dependencia de τm con el pH en cada una de las líneas celulares en las que se desee determinar el pH empleando dicho biosensor. Finalmente, mediante microscopía FLIM, se ha determinado de forma cuantitativa el pH de dos líneas celulares distintas, siendo a nuestro entender la primera vez que se estudia el pH de dichas líneas celulares empleando este tipo de microscopía.