Estudio in vitro del efecto de las células madre mesenquimales de líquido amniótico sobre la función plaquetaria

Resumen

Introducción: Las células madre mesenquimales (CMM) obtenidas a partir de tejidos extraembrionarios, respresentan una nueva fuente de células madre para su uso en terapia celular. Están exentas de los problemas éticos y potencial tumorogénico asociados a las células madre embrionarias. Y respecto a las células madre adultas, presentan una mayor capacidad de proliferación y de diferenciación. Una de las fuentes de las CMM es el líquido amniótico, las cuales han demostrado tener excelentes propiedades inmunomoduladoras, antiinflamatorias, así como baja inmunogenicidad y teratogenicidad en transplantes in vivo. Recientemente, se han descrito efectos secundarios, principalmente fenómenos trombóticos cuando se administran las CMM por vía intravenosa. Estos efectos adversos se han relacionado con una mayor expresión del factor tisular, el cual activaría la vía extrínseca de la coagulación produciendo finalmente trombina. Se ha visto como las CMM interactúan con otras células, entre ellas las plaquetas, elementos con un papel fundamental en la hemostasia. Objetivos: El objetivo prinicpal es evaluar el efecto in vitro de las células madre mesenquimales de líquido amniótico (CMM-LA) sobre la función plaquetaria. Como objetivos secundarios nos planteamos el aislamiento, cultivo, caracterización de CMM-LA obtenidas de partos a término, analizar el efecto de las CMM-LA sobre la agregación y adhesión, evaluar el efecto de las CMM-LA sobre la expresión de marcadores de activación plaquetaria y el estudio del efecto de las CMM-LA sobre los niveles citoplasmáticos del calcio plaquetario. Material y métodos: las CMM se obtuvieron de líquidos amnióticos (LA) de cesáreas programadas de partos a término. Posteriormente se cultivaron en medio Amniomed, realizando un seguimiento del cultivo cada 48-72 horas. A los 30 días, se evaluó su capacidad de diferenciación a condrocitos, adipocitos y osteocitos, así como su identificación realizando la caracterización fenotípica. Así mismo se llevó a cabo el análisis molecular de las CMM-LA. En cuanto al análisis del efecto de las CMM-LA sobre la función plaquetaria se realizaron los ensayos clásicos de PFA-100 y Multiplate. Por citometría de flujo también se analizó el efecto de las CMM-LA sobre la agregación plaquetaria, sobre la expresión de marcadores de activación plaquetaria y sobre los niveles citoplasmáticos del calcio plaquetar. Resultados: Los cultivos de CMM-LA mostraron alta proliferación, capacidad de diferenciación y expresaron los maracadores mesenquimales CD105+, CD90+ y CD73+ y los factores de la coagulación y adhesión: factor VIII, factor de von Willebrand, factor tisular y podoplanina, siendo negativas para los marcadores hematopoyéticos CD45- y CD34-. En cuanto al estudio del efecto de las CMM-LA sobre la función plaquetaria, no se observaron diferencias por el analizador PFA-100. Por el contrario, el sistema Multiplate y el análisis por citometría de flujo sí mostraron cambios en la agregación y activación plaquetaria (expresión de P-selectina) tanto basalmente como en presencia de agonistas. Al evaluar el calcio plaquetario por citometría de flujo, observamos como la presencia de CMM-LA produce un ligero aumento de calcio citoplasmático en las plaquetas aisladas, mantenido solo en presencia de calcio extracelular, por el contrario las plaquetas que si interaccionan con las CMM-LA mostraron un progresivo y significativo aumento del calcio citoplasmático. Al realizar los mismos experimentos con heparina, cuya función es inhibir la producción de trombina, se observaron cambios significativos en la agregación, donde se observó una reducción de la respuesta, en la activación donde se disminuyó aún más la expresión de P-selectina, y en el aumento de calcio citoplasmático plaquetario de los agregados. Conclusiones: El líquido amniótio obtenido de partos a término es una fuente adecuada para la obtención de CMM. Las CMM-LA inducen cambios en la función plaquetaria, independientemente de sus efectos procoagulantes.