Desarrollo de procesos biotecnológicos para la producción de anfidinoles y otros bioactivos de interés a partir de la microalga Amphidinium carterae

  1. Molina Miras, Alejandro
Supervised by:
  1. Francisco García Camacho Director
  2. Asterio Sánchez Mirón Co-director

Defence university: Universidad de Almería

Fecha de defensa: 26 November 2020

Committee:
  1. Sebastián Sánchez Villasclaras Chair
  2. Alfonso Robles Medina Secretary
  3. Ángeles Cid Committee member

Type: Thesis

Teseo: 642247 DIALNET

Abstract

La línea de trabajo seguida dentro de la presente investigación aborda aspectos concretos de etapas involucradas en el desarrollo de un bioproceso principalmente orientado a la producción sostenible de anfidinoles (APDs), un grupo de metabolitos secundarios producido por la microalga marina Amphidinium carterae (Infraphylum: Dinoflagellata; Clase: Dinophyceae). Los APDs son moléculas que presentan potentes actividades antifúngicas, hemolíticas y antitumorales. Los resultados más relevantes obtenidos se pueden resumir en: i) Se caracterizó morfológicamente y se identificó genéticamente la estirpe Dn241EHU de la especie de la microalga flagelada A. carterae; ii) los procesos de fotoaclimatación no producen un efecto negativo sobre el crecimiento de A. carterae. Esta especie ha demostrado una gran tolerancia a la luz, presentando una ventana operacional alrededor de Yave =100-400 μE•m−2•s−1, donde la velocidad máxima de crecimiento no se ve afectada; iii) se identificaron las condiciones de agitación óptimas para cultivar A. carterae en columnas de burbujeo. Esta especie es ligeramente más resistente que K. veneficum a la agitación, aunque, como suele ser común con la clase dinoflagellata, es mucho más sensible al cizallamiento que otras microalgas como N. gaditana; iv) se realizaron mejoras importantes en la composición del medio de cultivo. Por un lado, se comprobó que la formulación original del medio f/2 es totalmente deficiente en macronutrientes para alcanzar altas concentraciones celulares. Por otro, A. Carterae puede ser cultivada con diferentes fuentes de nitrógeno, combinadas o únicas en una amplia gama de concentraciones. Además, se pudo realizar la aclimatación con éxito hasta un porcentaje del 100% de medio de cultivo reutilizado, pudiéndose realizar un mínimo de 4 subcultivos sin que se observen efectos inhibitorios en el crecimiento; v) los cultivos en columnas de burbujeo de laboratorio pudieron escalarse con éxito hasta la escala planta piloto en un fotobiorreactor tipo columna de burbujeo (CB-FBR) iluminada con LEDs multicolor y con un volumen de cultivo de 80 L. La Pf volumétrica de biomasa alcanzó un valor de= 0,017 ± 0,001 g•L-1•d-1, mejorando los valores obtenidos a escala de laboratorio; vi) Así mismo, se cultivó en un fotobiorreactor tipo raceway (RW-FBR), con iluminación LED y volumen de trabajo de 33 L, de forma ininterrumpida durante ~1 año. Es la primera vez que se referencia un cultivo tan robusto y longevo con dinoflagelados en un FBR tradicional. La máxima Pf volumétrica de biomasa obtenida fue de 0,048 ± 0,001 g•L-1•d-1, valor que es muy superior a los obtenidos a cualquier escala en esta tesis; vii) se ha optimizado la operación de centrifugación discontinua para el cosechado sin provocar daño celular en A. carterae. La metodología desarrollada para identificar condiciones de operación seguras es extrapolable a otras líneas celulares sensibles; viii) se ha propuesto un proceso para purificar APDs a partir del sobrenadante del cultivo en la columna de burbujeo de escala piloto. La concentración en el sobrenadante del cultivo de luteophanol D, lingshuiol A y amphidinol 20 fue de 490, 191 y 152 µg•L-1; ix) en el cultivo realizado en el RW-FBR la concentración de APDs totales en la biomasa a lo largo del cultivo osciló entre 0,23-1,1% d.w. Los contenidos medios en la biomasa de EPA y peridinina convierten a A. carterae en una fuente potencial de estos bioproductos; x) se aplicó la novedosa técnica de análisis metabolómico mediante RMN acoplado a análisis de datos multivariados cuyos resultados sugieren que altos niveles de irradiancia y concentración de nutrientes favorecen la síntesis de APDs a costa de la generación de carbohidratos estando ambos, de alguna forma, relacionados. Además, se puso a punto un método de análisis cuantitativo con RMN de APDs; xi) el potencial biotecnológico de los APDs para su uso en la industria farmacéutica se fundamenta en su alta actividad hemolítica y antiproliferativa. Los resultados de las muestras de biomasa de A. carterae cosechadas presentaron una alta actividad hemolítica y antiproliferativa (<-80%) contra 4 líneas tumorales; xii) se logró realizar un cultivo de larga duración reutilizando el 100% del medio de cultivo en el RW-FBR durante casi tres meses sin pérdida de productividad de biomasa o de biproductos de interés. Estos resultados son los primeros que se referencian con dinoflagelados; y xiii) A. carterae potencialmente podría ser una microalga candidata para considerarse en la metodología de Acuicultura Multitrófica Integrada (IMTA), lo que ayudaría a la producción sostenible a media y gran escala de todas las moléculas de interés que produce (APDs, EPA, DHA y peridinina) bajo el concepto de bioeconomía circular.