Cultivo in vitro de esponjas marinasexperiencias con crambe crambe y axinella damicornis

Resumen

Las esponjas marinas representan una fuente potencial de muchos metabolitos únicos, incluyendo compuestos anticancerígenos. Varios compuestos bioactivos con actividades substanciales citotóxicas y antivirales han sido aislados de estas especies (Blunt et al., 2009). Sin embargo, el conocimiento de los requisitos nutritivos de esponjas marinas para mantener un cultivo in vitro eficiente y sostenido es insuficiente y no muy preciso. En el filo de invertebrados marinos, excepto porifera, se han hecho muchos intentos usando un medio comercial típico que se usa en el cultivo de células animales (especialmente insectos y células mamíferas) basado en fuentes de COD. Los medios de cultivos usados incluyen DMEM, RPMI, M199, L-15, etc. (Muldford et al., 2000). Una de las razones para este fracaso es el uso de promotores de crecimiento difícilmente identificables, basados en sueros de animales terrestres. Una alternativa para estos suplementos de origen terrestre es el uso de extractos isogénicos y alogénicos y/o sueros de animales marinos, que pueden contener nutrientes necesarios para el crecimiento. La biomasa de esponjas para la producción de los compuestos bioactivos es generalmente obtenida a partir de explantes cultivados en el mar y acuarios. Las esponjas cultivadas por estos métodos pueden estar, en la mayoría de los casos, contaminadas por varias poblaciones microbianas. En vista de ésto, el interés se centra en la posibilidad de utilizar cultivos puros de células de esponja en suspensión, y en agregados celulares (Primorfos) para la producción de los compuestos de interés. Se han establecido protocolos para obtención de suspensiones celulares primarias a partir del tejido de esponja (Müller et al., 1999), sin embargo no se ha obtenido ninguna línea inmortal de células (Belarbi et al., 2003a). Las células cultivadas en suspensión son expuestas a fuerzas de corte hidrodinámicas y mecánicas que no se dan en la matriz de la esponja. Igual que en la mayoría de los tipos de células animales (Chisti, 2000, 2001), las células de esponja libremente suspendidas son susceptibles de ser dañadas por estas fuerzas, pero no se dispone de ningún dato sobre tales efectos. Un problema esencial que dificulta el trabajo de quién se dedica a investigar con esponjas marinas es la disponibilidad del material biológico. Muchas veces resulta inviable la recolección del material biológico, bien por restricciones medioambientales o por problemas técnicas (el centro de experimentación se encuentra alejado del mar, malas condiciones climáticas, etc.). La criopreservación de trozos de esponjas marinas podría ser una buena solución para resolver este obstáculo. Esta técnica, también es de gran interés para facilitar el estudio de diversos procesos metabólicos que varían estacionalmente. Para abordar algunos de los problemas expresadas en párrafos anteriores se planificaron una serie de experimentos cuyos resultados y conclusiones se describen resumidamente a continuación. Cultivo de explantes de la esponja marina Crambe crambe en sistemas abiertos y cerrados. Los explantes de la esponja marina Crambe crambe fueron cultivados en agua marina natural y filtrada (FNFSW), con y sin adición de la microalga marina Phaeodactylum tricornutum en un sistema de flujo continuo y discontinuo (CFTHS y DFTHS, respectivamente). El control del crecimiento de los explantes se ha realizado midiendo su peso bajo el agua. En el experimento llevado a cabo en un sistema de flujo continuo (CFTHS), el peso bajo el agua de los explantes aumentó hasta un promedio de 1380% comparado con el peso inicial en un intervalo de tiempo comprendido entre 22 y 45 días dependiendo del explante. El crecimiento de los explantes cultivados en un sistema de flujo discontinuo (DFTHS), el peso bajo el agua de los explantes aumentó hasta un valor promedio del 322% respecto al peso inicial en un tiempo que osciló entre 102 a 210 días. Además, los explantes cultivados en DFTHS usando FNFSW con la adición de una suspensión de la diatomea Phaeodactylum tricornutum, el crecimiento, en peso, fue de un promedio del 2% por día. La cinética de crecimiento varió considerablemente para diferentes explantes. En los subcultivos realizados, los explantes crecieron más rápido en los primeros 10 días. Las elevadas velocidades de crecimiento observadas de explantes cultivadas en un sistema de flujo continuo (CFTHS) sugieren que la técnica del subcultivo es un método prometedor para cultivar la esponja marina Crambe crambe en sistemas abiertos. Cultivo de explantes de Crambe crambe en medios con nutrientes orgánicos disueltos. En primer lugar, se desarrolló una nueva metodología para demostrar el consumo de carbón orgánico disuelto (COD) por los explantes. Así, los experimentos fueron efectuados con explantes de la misma esponja adulta y el agua de mar artificial fue suplementado con diferentes concentraciones de fructosa para proporcionar concentraciones equivalentes de COD de 300, 400, 700 y 1200 mg L-1. El consumo fue evidente en las cuatro concentraciones ensayadas y fue más pronunciado durante las primeras 6 horas. Los datos de la asimilación del COD fueron ajustados al modelo empírico publicado por Ferguson (1980), usado extensamente para la cinética de consumo de compuestos orgánicos disueltos en invertebrados marinos. En segundo lugar, se estableció un protocolo para cultivar explantes in vitro. Se ensayaron diferentes medios a partir de un medio comercial RPMI 1640 enriquecido con sales inorgánicas típicas para generar agua de mar artificial y aminoácidos. Paralelamente se patentó un procedimiento para obtener un extracto de pulpo y utilizarlo como suplemento en el medio de cultivo. Los resultados obtenidos revelan que el uso del extracto de pulpo conjuntamente con el medio base enriquecido favorece notablemente el crecimiento de los explantes comparados con las formulaciones sin extracto, siendo, además, la sobrevivencia de los explantes claramente más alta. Esta mejora del crecimiento produjo una alta actividad metabólica en los explantes, como confirma el alto contenido del amonio y lactato en el medio después de unos días antes de su renovación y el consumo elevado de glucosa. La acumulación del lactato aumentó con el tamaño y la edad de los explantes. Previamente, se desarrolló un método alternativo y rápido, basado en el tratamiento de imagen digital, para la determinación precisa del volumen aparente del explante como medida de crecimiento. Modelo bioreacción-difusión para el crecimiento de explantes de esponja marina en biorreactores. Utilizando los datos de crecimiento obtenidos del cultivo in vitro de explantes en medios con nutrientes orgánicos disueltos, se desarrolló un modelo de crecimiento basado en el control del transporte por difusión de los nutrientes del medio circundante, a través de un sistema acuífero deficientemente desarrollado. Se asume que el crecimiento obedece a una cinética tipo Monod. El modelo explica satisfactoriamente el comportamiento de crecimiento de la esponja marina Crambe crambe medido en dos medios diferentes. Además, el modelo es consistente con datos publicados para el crecimiento de explantes de las esponjas Disidea avara y Hemimycale columella. Según el modelo y las observaciones experimentales, la velocidad de crecimiento instantáneo depende del tamaño del explante y de todos los factores de los que depende la difusión de nutrientes críticos al explante. Estrés mecánico e hidrodinámico en suspensiones de células de esponja. En este trabajo se demuestra cómo la viabilidad celular está afectada negativamente por las etapas del protocolo de Müller (1999) relacionadas con la turbulencia, siendo ésta un factor crucial a tener en cuenta en la optimización de los protocolos de disociación y reagregación celular dirigidos a cultivos de células de esponjas marinas en biorreactores. Los explantes de Axinella damicornis fueron disgregados según el protocolo de Müller (1999) y suplementando el agua de mar artificial libre de calcio y magnesio (CMFSW) con y sin el aditivo protector Pluronic F-68 (0.1% wt/v). El daño celular se redujo notablemente y se mejoró el rendimiento de la recuperación de las células viables en las cuatro etapas del protocolo de Müller. La agitación orbital a 75 rpm condujo prácticamente a la muerte de todas las células en menos de 2.5 horas, por el contrario la fracción viable y los niveles de debris celular permanecieron estables durante 6 h de agitación a 100 rpm en suspensiones suplementadas con PF-68. A 3ºC la viabilidad celular se mantiene durante más tiempo que a 17ºC. Mediante un modelo de cuatro etapas se describe la cinética de la muerte y de la fragmentación celular con un error del ± 10%. Ensayos de bioactividad de la esponja marina Crambe crambe. Estos experimentos se refieren al crecimiento de los explantes de Crambe crambe en T-flasks, efectuados en una cámara termostática [Ciclos Luz_Oscuridad (12h/12h) sin CO2] y en un incubador en oscuridad y con CO2, con el fin de analizar las Crambescidinas existentes en los explantes. La cuantificación de las Crambescidinas en la biomasa liofilizada fue realizada por la empresa PharmaMar. Los resultados obtenidos mostraron que una gran parte de los explantes perdieron sus capacidades citostáticas y citotóxicas después de unos días de cultivo. Está perdida importante de bioactividad de los explantes pudo ser debida a la modificación de factores que pueden afectar la composición de las sustancias bioactivos en esponjas marinas dentro de su hábitat natural. Criopreservación y subcultivo de explantes. Este estudio se ha centrado principalmente en la utilización de distintos medios de cultivo para la criopreservación de explantes y suspensiones celulares de la esponja marina Crambe crambe. La evaluación del efecto de la criopreservación se realizó a través del análisis de viabilidad celular por citometría de flujo y realizando subcultivos de explantes criopreservados. Los resultados obtenidos mostraron que para los tres periodos de criopreservación los medios RPMI+SW+E+EX con DMSO (10%) protegieron mejor a los explantes. Los explantes de la esponja marina Crambe crambe cultivados tras criopreservarlos experimentaron un crecimiento notable incluso conservaron la capacidad de adherirse entre ellos. Además, el principal inconveniente para el cultivo posterior a la criopreservación es fácil tenderse a la contaminación microbiológica, principalmente las producidas por hongos.