Evaluación biológica de nanoformulaciones asociadas a paclitaxel para el tratamiento del cáncer de pulmónmejora de la actividad antitumoral y reducción de los efectos secundarios

Zusammenfassung

El cáncer de pulmón es actualmente la principal causa de muerte por cáncer en el mundo, seguido por el de hígado, estómago y colon. En 2012 se registraron 1.8 millones de nuevos casos diagnosticados en el mundo. Asimismo, representa el tipo de cáncer con mayor índice de mortalidad, con 1.6 millones de casos mortales registrados en 2012, con una supervivencia a 5 años de un 18,1%. El paclitaxel (PTX), es un fármaco quimioterápico de elección en clínica para el tratamiento de diversos tipos de cáncer, entre los que se encuentra el cáncer de pulmón. Sin embargo, presenta numerosas limitaciones como la alta toxicidad sistémica, que obliga a menudo a suspender el tratamiento o a reducir la dosis administrada, con la consiguiente disminución de la eficacia antineoplásica. Concretamente, la neuropatía periférica dolorosa es uno de los efectos más indeseados del PTX, que afecta a más de un 60% de los pacientes tratados Otras de las limitaciones son su baja solubilidad en agua, lo que requiere el uso de excipientes orgánicos tóxicos como el Cremophor® EL, que presenta una elevada toxicidad y ha sido relacionado efectos secundarios, como son la hipersensibilidad aguda, neutropenia o neurotoxicidad, su rápida eliminación del organismo y la inducción en las células tumorales del desarrollo de mecanismos de resistencia, lo que reduce la respuesta al tratamiento de los pacientes. En este contexto, la nanotecnología se presenta como una herramienta potencial para solventar muchas de las limitaciones de la quimioterapia convencional. La encapsulación de fármacos en nanoformulaciones ha demostrado mejorar la efectividad antitumoral a través de diferentes mecanismos: i) incrementando la biodisponibilidad de los quimioterápicos ii) aumentando la solubilidad de los fármacos, lo que evita el uso de excipientes tóxicos; iii) permitiendo el direccionamiento específico hacia las células tumorales y; iv) reduciendo los efectos secundarios al disminuir la toxicidad sistémica. El presente trabajo de investigación se centra en el estudio de la actividad antitumoral de dos sistemas de nanoformulaciones cargadas con el fármaco PTX en modelos in vitro e in vivo de cáncer de pulmón. El principal objetivo de este estudio es mejorar el efecto antitumoral del PTX, potenciando su internalización celular, aumentando su biodisponibilidad in vivo y reduciendo su toxicidad sistémica asociada, con el fin de evitar el desarrollo de efectos secundarios tan severos como la neuropatía periférica dolorosa. En primer lugar, se han utilizado NPs poliméricas de ácido poli(láctico-co-glicólico) para la encapsulación de PTX, denominadas NPs de PLGA. El polímero de PLGA no solo presenta una alta biocompatibilidad y biodegradabilidad, sino que además está aceptado por la Food and Drug Administration de EEUU (FDA) y la European Medicines Agency (EMA) para su uso clínico en humanos, lo que lo convierte en un transportador ideal para los fármacos quimioterápicos. Estas NPs presentan un diámetro menor de 250 nm y un potencial eléctrico de -30 mV, lo que las hace apropiadas para la administración intravenosa. En segundo lugar, se emplearon liposomas catiónicos comerciales sintetizados por la empresa Nanovex Biotechnologies. Concretamente, se han utilizado dos liposomas con diferentes tamaños para la encapsulación del PTX: MLV, con un tamaño de 180-200 nm (MLV-PTX), y SUV, con un tamaño de 80-100 nm (SUV-PTX). Paralelamente, se sintetizaron estas formulaciones con una cubierta de polietilenglicol (PEG) para mejorar el tiempo de circulación in vivo de los liposomas (MLV-PEG-PTX y SUV-PEG-PTX). Con el fin de evaluar la toxicidad de ambas formulaciones sin fármaco, se realizaron ensayos de hemocompatibilidad con eritrocitos humanos y de citotoxicidad en las líneas de pulmón, en los que se observó una elevada biocompatibilidad con ambas formulaciones. Posteriormente, se evaluó el efecto antitumoral de las formulaciones cargadas con PTX, en comparación con el PTX libre, en las distintas líneas celulares de pulmón. Las NPs de PLGA mostraron una reducción de la IC50 del PTX de hasta 3.63 y 3.79 veces en las líneas tumorales humanas A549 y NCI-H460, respectivamente. Por su parte, las formulaciones lipídicas también lograron reducir significativamente la IC50 del fármaco. Concretamente, la formulación MLV-PTX fue la que presentó un mayor efecto antitumoral, con reducciones de 3.75 y 4.96 veces de la IC50 del PTX en las líneas tumorales A549 y la línea tumoral murina LL2. Además, se realizó un análisis del efecto antitumoral de las formulaciones en células madre tumorales aisladas de la línea A549. En este contexto, las NPs de PLGA lograron aumentar el efecto del fármaco a las dosis más bajas, mientras que, de las formulaciones lipídicas, solo MLV-PEG-PTX consiguió aumentar el efecto del PTX en estas células. Por otra parte, los estudios de internalización mostraron que ambos tipos de formulaciones incrementan significativamente la concentración intracelular del PTX, en comparación con el PTX libre. Para finalizar los estudios in vitro, se determinó la actividad antitumoral de las nanoformulaciones en modelos de esferoides tumorales de A549 y LL2, que remedan a los tumores in vivo. Para ello, se evaluó el volumen tumoral de estos esferoides tras la administración de los distintos tratamientos. Los resultados muestran que las NPs de PLGA ralentizan el crecimiento de los esferoides en mayor medida que los liposomas catiónicos, además de producir ambas un aumento en el porcentaje de apoptosis en estos MTS. Los ensayos in vivo se llevaron a cabo en ratones dela cepa C57BL/6, en los que se indujeron tumores subcutáneos mediante la inoculación de células tumorales de la línea LL2. Los ratones fueron sometidos a tratamiento con las diferentes NPs de PLGA y los liposomas catiónicos pegilados, vacíos y asociados a PTX. Los resultados obtenidos demuestran que los tratamientos no incrementan la toxicidad sistémica inducida por el PTX libre y que las tres formulaciones provocan una mayor disminución del volumen de los tumores (20%), en comparación con el fármaco libre. Además, los ensayos de biodistribución muestran que las NPs de PLGA con PTX mejoran la biodisponibilidad sistémica del fármaco, especialmente en el tejido pulmonar, además de aumentar la penetrabilidad del fármaco en el tejido cerebral. No obstante, los niveles de PTX en el tumor fueron menores que con el PTX libre, salvo a las 24 horas, cuando alcanzaron niveles similares, lo que sugiere que las NPs tardan más tiempo en acumularse en este tumor subcutáneo. En cuanto a los liposomas catiónicos, solo la formulación SUV-PEG-PTX mejoró significativamente la biodisponibilidad sistémica del PTX, mientras que MLV-PEG-PTX presentó un patrón más similar al PTX libre. La acumulación en el tumor fue mayor con el fármaco libre, salvo a las 24 horas, donde se una mayor acumulación de fármaco con SUV-PEG-PTX. Los estudios de neuropatía periférica dolorosa inducidos por PTX se realizaron mediante la determinación de alodinia mecánica e hiperalgesia por dolor en ratones tratados con PTX y con los liposomas catiónicos pegilados (MLV-PEG-PTX y SUV-PEG-PTX) en modelos de ratón CD-1. Los resultados mostraron que los liposomas de mayor tamaño protegían a los ratones del desarrollo de la hiperalgesia por calor y la alodinia mecánica, mientras que las formulaciones de menor tamaño y el PTX libre indujeron el desarrollo de la neuropatía, probablemente debido a que los liposomas de mayor tamaño no atraviesan las fenestraciones de los capilares de los DRGs, como también se observa en los estudios de biodistribución en los DRGs. En conclusión, los resultados de este trabajo de investigación demuestran que las NPs de PLGA y los liposomas catiónicos cargados con PTX son nanoformulaciones potenciales para la mejora del tratamiento del cáncer de pulmón, ya que presentan una alta biocompatibilidad, aumentan el efecto antitumoral del fármaco in vivo y pueden reducir algunos de los efectos secundarios más indeseados del PTX, como es la neuropatía periférica dolorosa.