Alteración en la metilación del ADN en el proceso de diferenciación osteogénico y miogénico de células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo

Zusammenfassung

Las células madre adultas son en la actualidad una potencial alternativa terapéutica para un gran número de patologías, que carece de limitaciones éticas y que son fácilmente obtenibles de los propios pacientes, evitando los problemas derivados de la incompatibilidad y el rechazo. En este contexto, las células madre mesenquimales aisladas de tejido adiposo han generado una enorme expectación e interés como alternativa terapéutica para el desarrollo de nuevas terapias en enfermedades del sistema músculo esquelético hasta ahora incurables o de mal pronóstico. En la presente Tesis Doctoral hemos optimizado y caracterizado el proceso de obtención de células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo y las hemos diferenciado hacia un linaje osteogénico y miogénico. Se han caracterizado las poblaciones obtenidas mediante un intenso estudio morfológico con microscopía óptica, electrónica y de barrido y se han determinado los principales marcadores osteogénicos y miogénicos mediante RT-PCR, Western Blot e inmunofluorescencia. En estudio, hemos encontrando depósitos de calcio y un incremento en la expresión en osteonectina, osteocalcina, osteopontina, elementos fundamentales en la matriz extracelular del tejido óseo, en el proceso de diferenciación osteogénica. Por otra parte, se ha evidenciado un incremento de desmina, actina, actinina o cadena pesada de la miosina en el proceso de diferenciación miogénica. Además, para ahondar en el conocimiento de los genes implicados en estos procesos y su relevancia en los mecanismos que lo inducen, hemos realizado un estudio de metilación, uno de los factores epigenéticos que determinan la identidad celular. El análisis de 27.578 CpG, nos ha permitido identificar 23 y 25 genes en la diferenciación osteogénica y miogénica respectivamente, con modificaciones de la metilación de las CpG en sus promotores en relación a las células madre de tejido adiposo. Una de las modificaciones más relevantes fue la del promotor del gen PIWIL2, que aparece hipermetilado tras ambos procesos de diferenciación disminuyendo su expresión drásticamente en las células de estirpe osteogénica y miogénicas obtenidas. Este hallazgo es, si cabe más importante, dada la recientemente demostrada relación entre PIWIL2 y los procesos de tumorogénesis. Para determinar exactamente su grado de implicación en los procesos de diferenciación, hemos silenciado PIWIL2 mediante RNA de interferencia, observando que esta pérdida de expresión se correlaciona con un incremento de marcadores de diferenciación osteogénica (osteopontina o fosfatasa alcalina) y miogénica (desmina y MEF2). Por tanto, PIWIL2, parece un gen fundamental en ambos procesos de diferenciación y deberá ser analizado en futuros estudios.