Valor pronóstico de la enzima O6-metilguanina-adn metiltransferasa (mgmt) y de la glicoproteina prominina 1 (cd133) en pacientes con cáncer colorrectal

  1. Oliver Esteve, Jaime Antonio
Supervised by:
  1. José Carlos Prados Salazar Director
  2. Consolación Melguizo Director
  3. Raúl Ortiz Quesada Director

Defence university: Universidad de Granada

Fecha de defensa: 10 October 2014

Committee:
  1. Antonia Aránega Jiménez Chair
  2. María Celia Vélez Fenández Secretary
  3. Ida Iolanda Mura Committee member
  4. Ana Rosa Rama Ballesteros Committee member
  5. Jaime Gómez Millán Barrachina Committee member

Type: Thesis

Abstract

Según la Organización Mundial de la Salud, el cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común en hombres y el segundo en mujeres estimando un aumento tanto de incidencia como mortalidad. Su principal tratamiento es la cirugía, combinándose con terapias adyuvantes basadas en quimioterapia y/o radioterapia. Una de las razones del fallo de tratamiento son las células madre cancerígenas o Cancer Stem Cells (CSC). Las CSCs son una pequeña subpoblación que presenta algunas propiedades compartidas con las células madre como: la capacidad de autorenovarse de forma indefinida, la capacidad de generar todo el repertorio de células que forman el tumor y presentar marcadores específicos propios, entre ellos CD133. Inicialmente, este biomarcador fue descrito como un antígeno de superficie específico de las células madre hematopoyéticas humanas y en los últimos años ha sido asociado a las CSCs en varios tipos tumorales incluyendo el CCR. Estudios previos in vitro, han sugerido que uno de los mecanismos responsables de la quimio y radiorresistencia en esta población es la O6-metilguanina-ADN metiltransferasa (MGMT). La expresión de esta enzima parece depender de procesos epigenéticos como la metilación y su función es la reparación del ADN, eliminando los grupos alquilo del átomo O6 de la guanina, introducidos por agentes alquilantes exógenos. Estudios previos sugieren que CD133 y MGMT podrían ser un elemento predictivo de la respuesta al tratamiento en algunos tipos de cánceres. Los principales objetivos en este estudio son la determinación de los niveles de expresión de MGMT y CD133 en los distintos niveles moleculares, establecer su valor pronóstico y las relaciones existentes entre ambos biomarcadores. En primer lugar, se realizó un estudio preliminar en líneas celulares de CCR para poner a punto todos los métodos y técnicas antes de aplicarlos a los pacientes y tener una aproximación de lo que podría suceder in vivo. Se dispuso de dos poblaciones de pacientes de las cuales se obtuvieron las variables clínicas más relevantes como el grado de diferenciación tumoral, el estadio tumoral, la supervivencia global (SG) y libre de enfermedad (SLE) entre otras. La primera población consistía en pacientes diagnosticados con CCR (n= 123) con biopsias antes del tratamiento, basado en regímenes que incluían 5-fluoracilo (5-FU) y la segunda población incluía pacientes con cáncer rectal (n= 29) con biopsias antes y después del tratamiento. Estos últimos pacientes se trataron con el mismo esquema basado en 5-FU o capecitabina oral y radioterapia. El estado de metilación del promotor de MGMT y CD133 se evaluó mediante PCR específica de metilación (MSP), la expresión de RNAm mediante RT-PCR y/o PCR cuantitativa y la expresión proteica mediante el estudio inmunohistoquímico (IHQ) de secciones en parafina o Tissue Micro arrays. Además en las líneas celulares enriquecidas en CSCs se analizó el ciclo celular y la inhibición de la proliferación celular frente a 5-FU. Los estudios preliminares en las poblaciones enriquecidas en CSCs en las líneas celulares RKO y SW480 mostraron que estas presentaban una menor tasa de proliferación, sobreexpresión de CD133 no valorable y 8,95 folds respectivamente) y MGMT (1,47 y 1,98 folds respectivamente), ausencia de bloqueo en G2/M al tratarlas con 5-FU y un incremento significativo de la concentración inhibitoria máxima media (IC50) a las 72 horas de exposición con 5-FU (64 y 2048 folds respectivamente). Los resultados en la población de pacientes con CCR (n= 123) mostraron que los pacientes con baja intensidad de expresión de MGMT presentaban una SG menor y era un factor pronóstico independiente. Por otra parte, los pacientes con alto porcentaje de expresión de CD133 presentaron una SLE más corta no siendo un factor pronóstico independiente. Del mismo modo, los pacientes con alta intensidad de expresión de MGMT y alto porcentaje de expresión de CD133 presentaron los tiempos de SLE y SG más cortos. Los resultados en la población con cáncer rectal (n= 29) mostraron que el estado de metilación de MGMT estaba asociado a periodos más cortos de SLE, ausencia de invasión linfática después del tratamiento y mejor respuesta al tratamiento. Además, pudimos apreciar una reducción significativa de los niveles de expresión proteica de MGMT tanto a nivel de porcentaje como intensidad después del tratamiento. Por otra parte, los pacientes con bajo porcentaje de expresión de MGMT después del tratamiento mostraron grados de regresión tumoral más bajos. Respecto a CD133, los pacientes con altos niveles proteicos de CD133 después del tratamiento se asociaron con estadios tumorales más avanzados, ausencia de cambios en la invasión linfática después del tratamiento y mayores grados de regresión tumoral. En ambas poblaciones de estudio no se observó ninguna asociación entre MGMT y CD133. Globalmente pudimos observar que en pacientes con CCR, la ausencia de expresión de MGMT y/o la metilación de su promotor se correlacionó con una respuesta favorable al tratamiento a corto plazo, mientras que a largo plazo, se asoció con una reducción de la SG. Por otra parte, CD133 lo asociamos a una pobre respuesta del tratamiento, periodos de SLE más cortos, y valores superiores del grado de regresión tumoral. Podemos concluir que tanto MGMT como CD133 tienen un papel relevante en la respuesta al tratamiento y en el pronóstico de los pacientes con CCR y consideramos que ambos biomarcadores podrían ser útiles para la selección de pacientes que requieran de terapias más agresivas.