Estudio de posibles elementos implicados en la determinación/diferenciación del sexo en lenguado (Solea senegalensis, Kaup 1868)familias génicas repetidas y genes candidatos

Resum

La Memoria de Tesis Doctoral trata sobre una profundización en la caracterización molecular y citogenética del lenguado senegalés (Solea senegalensis). Es una especie que tiene un alto potencial para la acuicultura que se ve obstaculizado por problemas de conducta reproductiva. En este estudio se intentan aplicar algunos enfoques experimentales para aumentar los recursos genómicos disponibles. Entre estas herramientas está la identificación de marcadores genéticos asociados con rasgos de interés comercial como la identificación sexo-específica, y desentrañar las bases moleculares de diferentes procesos fisiológicos como la determinación sexual. Es un valioso pez plano, siendo la primera vez que se aborda el mapeo y la caracterización de DNA repetido y la caracterización del gen dmrt1 en esta especie. En primer lugar, se ha realizado una investigación con cultivos celulares para optimizar la obtención de placas metafásicas para los análisis citogenéticos. Se analizaron condiciones de cultivo para los tres tejidos utilizados, sangre, bazo y riñón después de cambiar la combinación de los mitógenos. Los cultivos se suplementaron con dos mitógenos, fitohemoaglutinina y lipopolisacáridos, que proporcionaron unos índices mitóticos dispersos, sin haber obtenido resultados definitivos y reproducibles, aunque el uso del mitógeno fitohemoaglutinina se ha revelado con unos ligeros mejores resultados. En la segunda parte de la Tesis analizamos el contenido de las repeticiones de secuencia simple (SSR) y de los elementos transponibles (TEs) de cincuenta y siete clones BAC (que abarcan 7.9 Mb del genoma) de esta especie, ubicados en los cromosomas mediante la técnica de hibridación in situ de fluorescencia múltiple (m-BAC-FISH). El análisis SSR reveló una densidad promedio de 675.1 loci por Mb y se observó una alta abundancia (59.69%) de cobertura de dinucleótidos, siendo "AC" la más abundante. Con respecto a los TE, los transposones de ADN (Clase II) fueron los más abundantes. En la Clase I, los elementos LINE fueron los más abundantes y la familia hAT fue la más representada en la Clase II. La subfamilia Rex/Babar, observada en el mapeo de dos clones BAC en el par de cromosomas 1, mostró una coincidencia de 2551 pb para estos elementos. Este par de cromosomas se ha descrito recientemente como un proto-cromosoma sexual putativo en esta especie, destacando el posible papel del elemento Rex en la evolución del mismo. Finalmente, se realizó la caracterización molecular del gen dmrt1 que tiene una secuencia de cDNA de 2027 pb de longitud y 1206 pb de marco de lectura abierto (ORF) y que codifica una proteína de 402 aminoácidos. Se encontró el dominio DM característico en la proteína dmrt1 con la estructura característica "C2H2C4” para las posiciones de cisteínas e histidinas para formar el dedo de zinc y también un dominio SY, rico en serina y tirosina. Se han descrito múltiples isoformas obtenidas por RACE, rastreo BAC y PCR con primers entre exones I y IV, y también se ha encontrado la secuencia de un miRNA en el extremo 3´UTR. En el árbol filogenético construido a partir de la secuencia de aminoácidos deducida del gen dmrt1 se observa que la relación filogenética del gen dmrt1 de S. senegalensis fue consistente con la posición evolutiva de su especie, al estar cercana a las secuencias de otros peces planos. La estructura del gen, con un tamaño de 31,4 Kb, presenta 7 exones con una duplicación de los exones II y III inédita en las estructuras de dmrt1 hasta ahora conocidas, y 6 intrones. En el BAC que contiene al gen dmrt1, observamos diferentes DNAs satélites y regiones de baja complejidad que están dispersos, junto a transposones y retrotransposones de DNA que también están ampliamente distribuidos a lo largo de toda su secuencia. Flaqueando la región repetida encontramos la secuencia de un SINE en posición intrónica. Se propone que la duplicación de los exones se originaría mediante el mecanismo de barajado de exones mediado por el retrotransposón SINE detectado en la segunda región repetida en el gen drmt1.