Efecto de stenotrophomonas bentonitica bii-r7 sobre la movilidad de selenio, curio y europio en el marco del sistema de almacenamiento geológico profundo de residuos radiactivos

Resumen

1. Introducción La cada vez mayor producción de residuos radiactivos debido al extenso uso de la energía nuclear en la actualidad, se está convirtiendo en un problema ambiental a escala global para los seres vivos debido a sus graves riesgos asociados. Es bien sabido que estos residuos altamente peligrosos contienen materiales contaminados con radionúclidos, que deben ser almacenados durante largos periodos de tiempo hasta que su radiotoxicidad disminuya hasta niveles naturales. Por esta razón, la implementación de los almacenamientos geológicos profundos (AGPs) ha sido considerada por muchos países para su depósito seguro en un futuro próximo. Este sistema está basado en la encapsulación de residuos radiactivos en contenedores de acero, hierro, o cemento que serán depositados bajo tierra a una profundidad de 500-1000 m. Además, estos contenedores estarán rodeados por barreras naturales (roca hospedante) y de ingeniería (bentonitas, cementos, etc.) para su protección mecánica, hidráulica y termal. De hecho, las formaciones arcillosas jugarán un papel crucial en muchos diseños AGP tanto como roca hospedante y como barrera de ingeniería en países como Francia, Bélgica y Suiza. Concretamente, en España, arcillas de bentonita del Parque Natural de Cabo de Gata (Almería) han sido seleccionadas como material de referencia para barreras de ingeniería, debido a sus bien caracterizadas propiedades físicas y geoquímicas. Una amplia distribución de microorganismos ha sido previamente descrita en numerosos materiales seleccionados para su uso como barrera en los AGPs, incluyendo formaciones bentoníticas. Muchos estudios han evidenciado el papel que los procesos microbianos pueden tener sobre la corrosión metálica de contenedores, la transformación de minerales, la producción de gases y en la movilidad de los radionúclidos presentes en los residuos radiactivos, entre otras cosas. Como consecuencia de ello, los microorganismos podrían afectar la seguridad de los sistemas de AGP. Diversos mecanismos microbianos como la biotransformación, la biosorción, la biomineralización y la bioacumulación han sido previamente descritos por estar involucrados en la interacción con radionúclidos, probablemente afectando su movilización a través de estos almacenamientos. Entre los radionúclidos presentes en los residuos radiactivos, el selenio (Se) y el curio (Cm) son de gran interés. El Se es un componente común del combustible nuclear gastado, existente en los residuos radiactivos principalmente en forma del isótopo 79Se (3.7 x 105 años de vida media). Este elemento puede existir en la naturaleza en diferentes estados de oxidación: +VI, +IV, 0, and –II. Selenito (SeIV) y selenato (SeVI) son las formas más solubles y tóxicas, mientras que el Se elemental (Se0) y el seleniuro (Se-II) son básicamente insolubles. Por otro lado, el Cm es un elemento altamente radiotóxico también presente en el combustible nuclear gastado, principalmente en forma de los isótopos 247Cm and 248Cm. Las excelentes propiedades luminiscentes de este elemento, como representante de actínidos trivalentes (AnIII), son idóneas para el estudio de su especiación química a concentraciones relevantes para el medio ambiente. De la misma manera, el europio (Eu), análogo inactivo de AnIII, también presenta excelentes propiedades luminiscentes. Esta inactividad hace al Eu un elemento ideal para estudios de especiación sobre AnIII. El principal objetivo de esta Tesis Doctoral consiste en estudiar el papel de la cepa bacteriana aislada de bentonitas, Stenotrophomonas bentonitica, sobre la especiación y movilización de Se, Cm y Eu simulando las condiciones de los almacenamientos geológicos (aerobiosis, anaerobiosis y alcalinidad) con el objetivo de evaluar su impacto sobre la seguridad de los sistemas de AGP. Para este fin, una metodología multidisciplinar combinando técnicas espectroscópicas, microscópicas y microbiológicas fue empleada. Se estima que unas condiciones aerobias dominen los AGPs después de su cierre, ya que el oxigeno se introducirá durante su construcción y periodos operacionales. Posteriormente, un ambiente anóxico será establecido. Además, condiciones alcalinas (~ pH 10-12) dominarán en aquellos almacenamientos que utilicen materiales cementosos como referencia. 2. Resultados y discusión En primer lugar, la cepa de estudio, previamente aislada de formaciones bentoníticas españolas durante estudios de diversidad dependientes de cultivo, fue analizada a nivel molecular y fenotípico. Los análisis claramente indicaron que este aislado representa una nueva especie dentro del género Stenotrophomonas, para el cual el nombre Stenotrophomonas bentonitica fue propuesto, con BII-R7T como cepa tipo (= LMG 29893T = CECT 9180T = DSM 103927T). De acuerdo con la literatura revisada, otras especies dentro del género Stenotrophomonas muestran una elevada tolerancia a numerosos elementos tóxicos como cadmio, zinc, selenio, cobre, telurio, uranio, etc. En este sentido, el genoma de S. bentonitica contiene genes que codifican para enzimas específicas (glutatión reductasa, tiorredoxina reductasa, fosfatasa alcalina, etc.) previamente descritas por estar implicadas en la tolerancia e inmovilización de elementos peligrosos para el ambiente, como el Se, y algunos actínidos, como el uranio. Estos estudios genómicos también revelaron la presencia de genes codificantes para la formación de biopelículas (flhA, flhB, fliR, fliQ, fliP, fliN, fliM, slp), que podrían incentivar la inmovilización de estos elementos en el marco de los sistemas de AGP a través de diferentes mecanismos de interacción como la biosorción o la acumulación intracelular. En segundo lugar, el impacto de S. bentonitica sobre la especiación química de Se bajo condiciones aerobias fue evaluado. Las células de S. bentonitica son capaces de reducir SeIV a Se0 tal y como indicaron los precipitados rojos producidos en los cultivos suplementados con este oxoanión. El contenido total de SeIV fue completamente reducido cuando las células fueron cultivadas bajo diferentes concentraciones iniciales. A pesar de que el crecimiento, la viabilidad, y la actividad bacteriana fue afectada negativamente por el SeIV, las células fueron capaces de crecer y mantenerse viables y activas. El SeIV fue reducido en forma de nanopartículas de Se0 con diferentes formas (esférica, hexagonal, poligonal, nanofibras) y propiedades cristalinas (amorfas y trigonales cristalinas) tal y como revelaron los análisis con microscopía (STEM/HAADF) y difracción de rayos X (XRD). Nanoesferas de Se amorfo (a-Se) fueron inicialmente sintetizadas tras 24 h de incubación, empezando a formar agregados posteriormente, tras 48 y 72 h. Después de 144 h, nanopartículas de selenio (SeNPs) cristalino con una estructura trigonal en forma hexágonos, polígonos y nanofibras, fueron detectadas. Un proceso de transformación dependiente del tiempo desde nanoesferas de a-Se a diferentes nanoestructuras de Se trigonal (t-Se) fue propuesto, en el cual la materia orgánica (probablemente correspondiente a proteínas tipo-flagelo) asociada a las nanopartículas parece estar involucrada. Posteriores estudios espectroscópicos (FTIR y XPS) y microscópicos sobre SeNPs purificadas demostraron la presencia de materia orgánica rica en grupos amino recubriendo a las mismas. Estos resultados confirmaron el posible rol de las proteínas en la síntesis y transformación de SeNPs. Sin embargo, estudios adicionales son necesarios para un mejor entendimiento sobre el papel específico de estas envueltas proteicas. La estructura local de las nanoestructuras de Se producidas biológicamente fue además investigada mediante espectroscopia de absorción de rayos X (XAS). El análisis mediante XANES (X-ray absorption near edge region spectroscopy) confirmó el estado de oxidación 0 de estas nanoestructuras de Se. Además, el análisis mediante EXAFS (extended x-ray absorption fine structure) nos permitió confirmar su estructura tanto amorfa como cristalina. Los mayores valores obtenidos del factor Debye-Waller (2) de la primera esfera de coordinación (Se-Se1) en la muestra incubada durante 24 h, en comparación con las muestras a 72 y 144 h, indicaron un aumento en el orden estructural conforme aumenta el tiempo de incubación. Estos resultados apoyarían el proceso de transformación y cristalización previamente sugerido a partir de los resultados obtenidos mediante microscopía y espectroscopia. Finalmente, la detección de compuestos volátiles metilados de Se como DMDSe (dimethyl diselenide) y DMDSeS (dimethyl selenenyl sulphide) producidos por las células de S. bentonitica, evidenció la implicación del proceso de volatilización como mecanismo de interacción. Este hecho, también confirmó la habilidad de las células en reducir SeIV a especies metiladas de menor toxicidad en un estado de oxidación –II. La reducción biológica de SeIV fue también estudiada bajo condiciones anaeróbicas y alcalinas simulando las esperadas en los AGPs. A diferencia de los experimentos en aerobiosis descritos anteriormente, bajo estas condiciones más desfavorables se detectó la ausencia de crecimiento microbiano y una menor viabilidad y actividad metabólica. Sin embargo, las células de S. bentonitica mostraron su capacidad para reducir SeIV anaeróbicamente desde pH neutro hasta alcalino (pH 7-10) tal y como indicaron los precipitados rojos observados. De forma similar a los resultados obtenidos en condiciones aerobias, los productos de Se procedentes de este proceso de reducción fueron acumulados en forma de diferentes SeNPs rodeadas por materia orgánica y proteínas tipo-flagelo. La presencia de nanoestructuras de t-Se, además de otras fases termodinámicas intermedias como a-Se y Se monoclínico (m-Se), confirmaron un proceso de transformación similar al descrito anteriormente bajo condiciones aerobias. Sin embargo, la menor cantidad de nanoestructuras de t-Se encontradas bajo condiciones anaerobias y alcalinas, sugirieron un mecanismo de transformación de mayor lentitud, probablemente provocado por este ambiente de mayor estrés. Los bajos niveles de crecimiento, actividad y viabilidad parecen afectar al proceso de reducción y al de transformación hacia cristales de Se. Finalmente, las interacciones moleculares de CmIII y EuIII con S. bentonitica fueron analizadas tanto aeróbica como anaeróbicamente. Un gran número de técnicas incluyendo espectroscopia, microscopía, y titulaciones potenciométricas fueron empleadas para llevar a cabo un estudio más completo y exhaustivo. Las titulaciones potenciométricas proporcionaron datos cuantitativos sobre los tipos y concentraciones de los grupos funcionales de la superficie celular implicados en la unión de EuIII. Según esta técnica, los grupos fosfato podrían actuar como el principal sitio de unión para la interacción. Los resultados de espectroscopia infrarroja (ATR-FTIR) concordaron con la implicación de los grupos fosfato y sugirieron, además, que los grupos carboxilo podrían formar complejos puente de unión con el EuIII. Los análisis realizados con espectroscopia de fotoelectrones emitidos por rayos X (XPS) también sugirieron que los grupos carboxilos presentes en determinados ácidos orgánicos, como el acetato, podrían participar en la interacción con el EuIII. Adicionalmente, la espectroscopia de fluorescencia (TRLFS) confirmó la participación de los grupos carboxilo y fosforilo en la acomplejación de CmIII/EuIII al comparar los parámetros de luminiscencia obtenidos con la bibliografía publicada. Por último, los análisis de microscopía mostraron que S. bentonitica interacciona con EuIII principalmente a través de un proceso de biosorción sobre la superficie celular. Sin embargo, la presencia de precipitados de EuIII intra y extracelulares indicó que otros mecanismos como la bioacumulación o la bioprecipitación podrían estar involucrados en la interacción. De hecho, los estudios cinéticos apoyaron claramente el posible rol de más de un mecanismo de interacción. 3. Conclusiones  El estudio de las interacciones moleculares con Se bajo condiciones aerobias, anaerobias y alcalinas demostraron el impacto sustancial de los procesos microbianos llevados a cabo por S. bentonitica sobre la especiación y movilidad del Se. El Se producido en forma de cristales de Se0 y de compuestos metilados como resultado de un proceso de reducción, podrían tener un papel beneficioso en la seguridad de los sistemas de almacenamiento geológico debido a su conocida menor movilidad y toxicidad, respectivamente.  Los estudios moleculares sobre las interacciones con EuIII/CmIII bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas demostraron la influencia de los procesos microbianos llevados a cabo por S. bentonitica en la movilidad de EuIII y CmIII. Los resultados obtenidos proponen que S. bentonitica juega un papel importante en la inmovilización de AnIII a través de su biosorción y su potencial habilidad para formar biopelículas dentro de los sistemas de AGP. Además, la más que probable bioprecipitación de AnIII por las células podría también dar lugar a su inmovilización. Sin embargo, la poca cantidad de precipitados de EuIII intracelulares encontrados, descartó la acumulación intracelular como un mecanismo con un impacto significativo en los repositorios. En cualquier caso, más estudios y evidencias son necesarios para elucidar el rol específico de S. bentonitica sobre la seguridad de los futuros almacenamientos geológicos de residuos radiactivos. SUMMARY FOR THE DATA BASE OF DOCTORAL THESES (TESEO). MINISTERY OF EDUCATION. TITLE OF THE THESIS: EFFECT OF STENOTROPHOMONAS BENTONITICA BII-R7 ON THE MOBILITY OF SELENIUM, CURIUM, AND EUROPIUM WITHIN THE DEEP GEOLOGICAL REPOSITORY SYSTEM OF RADIOACTIVE WASTE. Miguel Angel Ruiz Fresneda 1. Introduction Nowadays, the increasing generation of radioactive waste due to the extensive use of the nuclear industry is becoming a global environmental concern for living organisms due to their serious associated risks. It is well known that these extremely hazardous residues contain materials contaminated with radionuclides, which must be stored for a long period of time until their radiotoxicity decrease to natural levels. For this purpose, the implementation of the deep geological repositories (DGRs) has been considered by many countries for their safely disposal in the near future. This system is based on the encapsulation of radioactive wastes in steel, iron or concrete containers that will be placed underground at a depth of 500-1000 m. In addition, the containers will be surrounded by natural (host rocks) and engineered barriers (bentonite, cementitious materials, etc.) for their mechanical, hydraulic, and thermal protection. Indeed, the clay formations will play a crucial role in many DGR design as host rock and engineered-barrier in countries such as France, Belgium, and Switzerland. Specifically, in Spain, bentonite clays from Cabo de Gata (Almería) have been selected as a reference material for engineered barriers because of their well characterized physical and geochemical properties. A widely distribution of microorganisms has been previously reported in many materials selected for their use as barrier for DGR, including bentonite formations. Many studies have evidenced the role that microbial processes may play on the metal corrosion of containers, transformation of clay minerals, gas production, and mobility of radionuclides present in radioactive wastes, among others. As a consequence, microorganisms could affect the security of the DGR system. Several microbial mechanisms such as biotransformation, biosorption, biomineralization, and bioaccumulation have been previously described to be involved in radionuclide interaction, probably affecting their migration behavior through the disposal. Among the radionuclides present in radioactive waste, selenium (Se) and curium (Cm) are of great interest. Se is a common component of the spent nuclear fuel present in radioactive waste mainly as 79Se isotope (half life 3.7 x 105 years). This element can exist in nature in different oxidation states: +VI, +IV, 0, and –II. Selenite (SeIV) and selenate (SeVI) are the more soluble and toxic forms, while elemental Se (Se0) and selenide (Se-II) are basically insoluble. On the other hand, Cm is a highly radiotoxic element also present in nuclear spent fuel mainly as 247Cm and 248Cm isotopes. The excellent luminescence properties of this element, as a representative of trivalent actinides (AnIII), are suitable for the study of their chemical speciation at environmentally relevant concentration. In the same way, europium (Eu), an inactive analogue of AnIII, also provide excellent luminescence properties. This inactivity makes Eu an optimum element for speciation studies about AnIII. The main objective of this doctoral thesis is to study the role of the bentonite-isolated bacterium Stenotrophomonas bentonitica on the speciation and migration behaviour of Se, Cm, and Eu simulating geodisposal conditions (aerobic, anaerobic, alkaline) with the aim of evaluating its impact on the safety of the DGR system. For this purpose, a multidisciplinary approach combining spectroscopic, microscopic, and microbiological techniques was employed. Aerobic conditions are expected to dominate the DGRs after closure since oxygen will enter during the construction and operational periods. After that, anoxic conditions will be established. In addition, alkaline conditions (~ pH 10-12) will dominate in those disposal that use cementitious materials as reference. 2. Results and discussion Firstly, the bacterial strain of study, previously isolated from Spanish bentonite formations during a culture-dependent microbial diversity study, was analysed at molecular and phenotypic level. These analyses clearly indicated that the isolate represents a novel species within the genus Stenotrophomonas, for which the name Stenotrophomonas bentonitica sp. nov. was proposed with BII-R7T as the type strain (= LMG 29893T = CECT 9180T = DSM 103927T). According to the literature reviewed, other species within the genus Stenotrophomonas shows high tolerance to numerous toxic elements such as cadmium, zinc, selenium, copper, tellurium, uranium etc. In this sense, the genome of S. bentonitica contains genes coding for specific enzymes (glutathione reductase, thioredoxin reductase, alkaline phosphatase, etc.) previously described for their involvement in tolerating and immobilizing environmentally hazardous elements such as Se and some actinides (e.g. uranium). These genomic studies also revealed the presence of genes coding for proteins involved in the formation of biofilms (flhA, flhB, fliR, fliQ, fliP, fliN, fliM, slp), which could enhance the immobilization of these elements within the DGR system through different interaction mechanisms such as biosorption or intracellular accumulation. Secondly, the impact of S. bentonitica on the chemical speciation of Se under aerobic conditions was evaluated. S. bentonitica cells are able to reduce SeIV to Se0 as indicated the red precipitates produced in the cultures supplemented with this oxyanion. The total SeIV content was completely reduced when the cells were grown under different initial concentrations, indicating the high efficiency of the cells in reducing SeIV. Despite the bacterial growth, viability, and activity was negatively affected by SeIV, the cells were able to growth and maintain viable and active. SeIV was reduced in form of Se0 nanoparticles with different shapes (spherical, hexagonal, polygonal and nanowires) and crystallographic properties (amorphous and trigonal) as revealed microscopy (STEM/HAADF) and X-ray diffraction (XRD). Amorphous Se (a-Se) nanospheres were initially synthesized after 24 h of incubation and then, they started to form aggregates from 48 to 72 h. After 144 h, crystalline selenium nanoparticles (SeNPs) with trigonal structure in form of hexagons, polygons and nanowires were also detected. A time-dependent transformation process from a-Se nanospheres to different trigonal Se (t-Se) nanostructures was proposed, in which organic matter (probably corresponding to flagella-like proteins) attached to the nanoparticles seems to be involved. Further spectroscopic (FTIR and XPS) and microscopic studies of purified SeNPs demonstrated the presence of amine rich organic matter coating them. These results confirmed the possible role of proteins in the synthesis and transformation of SeNPs. However, additional studies are needed to better understand the specific role of protein coating. The local structure of the bioproduced Se nanostructures was further investigated by X-ray Absorption Spectroscopy (XAS). X-ray absorption near edge region spectroscopy (XANES) confirmed the zero-valent oxidation state of these Se nanostructures. In addition, extended x-ray absorption fine structure (EXAFS) allowed to confirm their amorphous and crystalline structure. The higher Debye-Waller factor (2) values of Se-Se1 shell in the sample incubated for 24 h comparing with 72 and 144 h samples indicated an increase in the structural order with incubation time. These results would support the transformation and crystallization process previously suggested by microscopic and spectroscopic techniques. Finally, the detection of volatile methylated Se species such as dimethyl diselenide (DMDSe) and dimethyl selenenyl sulphide (DMDSeS) produced by S. bentonitica cells pointed out the involvement of volatilization as interaction mechanism. This fact also confirmed the ability of the cells to reduce SeIV to the less toxic methylated species in the -II oxidation state. The biological reduction of SeIV was also studied under anaerobic and alkaline conditions simulating those expected in DGRs. In contrast to aerobic experiments mentioned above, no cell growth and lower viability and activity was detected under these more stressful conditions. However, the cells of S. bentonitica showed their capacity to reduce SeIV anaerobically from neutral to alkaline pH (pH 7-10) as indicated by the observed red precipitates. Similarly to the results obtained aerobically, the Se products derived from the reduction process were accumulated in form of different SeNPs surrounded by organic matter and flagella-like proteins. The presence of t-Se nanostructures in addition to other intermediate thermodynamic phases such as a-Se and monoclinic Se (m-Se) confirmed a similar transformation process as previously described under aerobic conditions. However, the lower amount of t-Se nanostructures observed under anaerobic and alkaline conditions suggested a slower transformation mechanism probably influenced by this stressful environment. The low levels of cell proliferation, activity, and viability seem to affect the reduction and transformation to Se crystals. Finally, the molecular interactions of CmIII and EuIII with S. bentonitica were analysed both aerobically and anaerobically. A large number of techniques including spectroscopy, microscopy, and potentiometric titrations were employed to provide a more comprehensive and complete study. Potentiometric titrations provided quantitative data about the type and concentration of functional groups from the cell surfaces involved in the EuIII coordination. According to this technique, phosphate groups could serve as the main binding site involved on the interaction. Infrared spectroscopy (ATR-FTIR) results agreed with the implication of phosphate groups and also suggested that carboxyl groups could form bidentate bridging complexes with EuIII. X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) analysis also suggested carboxyl groups from organic acids such as acetate to participate in the EuIII complexation. Additionally, TRLFS confirmed the phosphoryl and carboxyl groups to be involved in the CmIII/EuIII complexation by comparing the luminescence parameters obtained with the published literature. Finally, microscopic analyses showed that S. bentonitica mainly interact with EuIII by a biosorption process on the cell surface. However, the presence of intracellular and extracellular EuIII precipitates pointed out that other mechanisms such as bioaccumulation or bioprecipitation could be implicated in the interaction. Indeed, kinetic studies clearly supported the possible role of more than one mechanism. 3. Conclusions  Definitely, the study of the molecular interactions with Se under aerobic, anaerobic, and alkaline conditions demonstrated the substantial impact of microbial processes derived from S. bentonitica on Se speciation and mobility. The Se produced in form of Se0 crystals and methylated compounds as a result of the reduction process may play an important beneficial role on the security of the geodisposal system due to their well-documented lower mobility and toxicity, respectively.  Definitely, the study of the molecular interactions with EuIII/CmIII under aerobic and anaerobic conditions demonstrated the influence of microbial processes derived from S. bentonitica on EuIII/CmIII mobility. The obtained results proposed S. bentonitica to play an important role in the immobilization of AnIII through their biosorption and the potential ability of the cells to form biofilms within the DGR system. Additionally, the probable bioprecipitation of AnIII by the cells could also lead to their immobilization. However, the low amount of intracellular EuIII precipitates, discarded bioaccumulation as a mechanism with a significant impact in the repositories. In any case, more studies and evidences are necessary to elucidate the specific role of S. bentonitica on the security of the future repositories of radioactive waste.