Base genética del cambio de fase en la langosta del desierto Schistocerca gregaria

Resumo

Resumen para la base de datos TESEO de la Tesis Doctoral elaborada por Rubén Martín Blázquez y titulada “Base genética del cambio de fase en la langosta del desierto Schistocerca gregaria Forskal” Las plagas de langosta son un mal que afecta a varias decenas de países, invirtiéndose mucho dinero y recursos tanto en su control como en compensar las pérdidas causadas por ésta. El fenómeno por el cual las langostas desarrollan una tendencia a agregarse y formar enjambres es un caso de polifenismo denominado cambio de fase. Pese a que se tiene un amplio conocimiento en los activadores de este fenómeno en varias especies de langosta, la regulación genética del mismo aún no está claramente dilucidada. Esta tesis trata de abordar las consecuencias genéticas del cambio de fase en la langosta del desierto Schistocerca gregaria Forskal comparando los patrones de expresión genética global que acontecen entre la fase gregaria y la fase solitaria de esta especie. Para ello hemos desarrollado métodos para cuantificar el grado de gregariedad que un individuo de langosta puede presentar, hemos secuenciado, ensamblado, analizado y comparado los transcritos expresados en el sistema nervioso central y el tubo digestivo de adultos gregarios y solitarios. Los resultados se han validado tanto con qPCR como mediante comparación bibliográfica de otros trabajos de S. gregaria y de la langosta migratoria Locusta migratoria. Con los resultados obtenidos, se ha estudiado una familia de proteínas quimiosensoras (chemosensory proteins, CSPs) entre cuyos integrantes hay proteínas implicadas en la activación del cambio de fase. En el capítulo 1 de esta tesis desarrollamos una herramienta que permite estimar el estado de gregariedad de un individuo de langosta basándonos en datos de comportamiento y morfología. Para ello, realizamos grabaciones de cómo respondían individuos criados a distintas densidades de población (aisladas y a 150 individuos por jaula) ante un grupo de langostas gregarias, además de tomar medidas morfológicas de los individuos experimentales. Con los resultados de estos estudios, se calcularon diez variables de comportamiento y tres de morfometría. Estudiamos el efecto del sexo, el tamaño y la especie sobre las variables y tras neutralizar el efecto del tamaño, que se resolvió normalizando las variables de comportamiento con la longitud del fémur de cada individuo, confeccionamos varios modelos para cada especie, basados en regresión múltiple logística que fueron validados con grupos externos de langostas criadas en densidades intermedias. Como resultado obtuvimos cuatro ecuaciones de modelos validados con y sin variables morfométricas para S. gregaria y para L. migratoria. Ambos modelos de S. gregaria lograron caracterizar a las ninfas con precisión, aunque sólo el modelo sin morfometría logró caracterizar a los adultos con precisión. Los modelos de L. migratoria funcionaron para caracterizar ninfas pero no lograron clasificar correctamente a los adultos. Estos modelos se encuentran recogidos en un programa informático escrito en R para facilitar estudios posteriores. El capítulo 2 de esta tesis se centra en el estudio del transcriptoma del sistema nervioso central de las fases gregaria y solitaria de S. gregaria. Mediante un ensamblaje sin referencia de dos librerías de secuencias de ARN mensajero provenientes de tejido enriquecido en sistema nervioso central de ambas fases gregaria y solitaria, analizamos funcional y cuantitativamente los genes encontrados en el mismo. La anotación de las secuencias permitió identificar 17,620 transcritos con resultado BLAST único, dejando 34,696 transcritos no redundantes sin anotación conocida. Los análisis de términos funcionales de las bases de datos Gene Ontology, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes e InterProScan nos muestran enriquecimiento de términos relacionados con la neurotransmisión y la sinapsis, así como otras funciones relacionadas con el transporte de energía, la respuesta a estímulos y la respuesta al estrés. El análisis de expresión diferencial nos mostró que el sistema nervioso central de la fase gregaria presenta una mayor actividad transcripcional presentando casi 100 veces más transcritos sobre- expresados con respecto a la fase solitaria. Los resultados de este capítulo no solamente ofrecen una lista de candidatos a estudiar como secuencias que afecten al cambio de fase, sino que también nos permite estudiar el proceso a nivel de rutas metabólicos y procesos de regulación completos. También nos da una idea de la magnitud y complejidad del cambio de fase a nivel de regulación neural, afectando a la expresión de casi el 50 % de los transcritos (anotados y no anotados) estudiados. En el capítulo 3 elaboramos un estudio del transcriptoma del tubo digestivo con metodología análoga al capítulo anterior pero con un enfoque ligeramente distinto. En este caso obtuvimos un transcirptoma de referencia con secuencias de las fases gregaria y solitaria de todo el tubo digestivo, con 57.637 transcritos con único resultado BLAST y 16.491 transcritos sin anotar. Este alto número de resultados BLAST fue debido a la secuenciación de microorganismos simbiontes y patógenos de la flora intestinal. Encontramos que 5.247 transcritos con resultado BLAST pertenecen a organismos no pertenecientes al reino animal, de los cuales 1.073 pueden derivar de un apicomplejo del género Gregarina spp., con enriquecimiento de transcritos de regulación por ubiquitina y apoptosis, siendo la profundidad de lecturas alineadas a estos transcritos significativamente mayor en la fase gregaria. Este estudio también permitió descubrir la presencia de transcritos bacterianos (pertenecientes a los géneros Escherichia, Enterobacter y Bacteroides, entre otros) y fúngicos (sobre todo del género Fomitopsis). En cuanto a secuencias específicas de la langosta, encontramos que los procesos relacionados con la lisis de proteínas (enzimas digestivos sobre todo), la detoxificación (como las glutatión S-transferasas o los citocromos P450) o el estrés (como las proteínas de choque térmico) son abundantes en general entre los transcritos anotados. Entre los genes diferencialmente expresados encontramos transcritos del sistema inmune, regulación del calcio y apoptosis en la fase gregaria comparado con transcritos de membrana peritrófica y estructuras musculares de la fase solitaria, dando a entender un contraste entre un tubo digestivo gregaria bajo infección y otro tubo digestivo solitario que invierte más en mantenimiento de estructuras como el músculo o la matriz epitelial. El capítulo 4 es un estudio comparativo entre los dos transcirptomas, así como entre varios trabajos ómicos que abordan el cambio de fase tanto de S. gregaria como de L. migratoria. Comparando los resultados de la anotación, encontramos que casi 3.000 transcritos únicos presentaban idéntico resultado BLAST entre los dos transcriptomas, y que solamente 14 presentaron idénticos perfiles de expresión. Entre los que presentaron un patrón común de sobre-expresión en gregarios, cabe destacar la pacifastina 4, el inhibidor de serina proteasa 3 y el gen black; los dos primeros relacionados con el sistema inmune y el tercero relacionado con la mecanización y las catecolaminas. Con respecto a las secuencias no anotadas, al agrupar mediante alineamientos las secuencias de nervioso y digestivo, descubrimos que un buen porcentaje de ellas están presentes en ambos transcriptomas, pudiendo ser posibles secuencias funcionales que no han sido caracterizadas aun. La validación mediante qPCR del transcriptoma del sistema nervioso fue un éxito, con 10 de 12 transcritos presentando un patrón de expresión significativo idéntico en los dos estudios, aunque la tendencia se rompe cuando se compara con muestras de distintos tejidos, estadíos de desarrollo o incluso con otra especie. Para concluir este capítulo, se llevó a cabo un estudio comparativo entre los resultados de expresión de seis trabajos, obteniéndose distintos niveles de concordancia y apuntando a secuencias que posiblemente sean marcadoras o determinantes en el cambio de fase. Los transcritos con congruencia absoluta resultaron ser dos: el de la anexina IX y una proteína unkempt con un motivo RING finger, ambos sobre- expresadas en fase gregaria y con un papel por determinar en el cambio de fase. El capítulo 5 abarca el estudio de una familia de proteínas, las CSP (Chemosensory proteins), mediante el estudio de secuencias genómicas y transcriptómicas de acceso público de L. migratoria y de nuestros datos de 5 transcriptomas (los dos estudiados más músculo torácico, ovarios y testículo) de S. gregaria. Realizando un estudio inicial basado en búsquedas BLAST sobre el genoma de L. migratoria y alineamientos con fragmentos de secuencias expresadas (ESTs), logramos caracterizar 57 loci que contienen CSPs en esta especie, siendo confirmadas por su patrón de cuatro cisteínas y su estructura típica de dos exones. Análogamente, se realizó otra búsqueda BLAST sobre nuestros transcriptomas de S. gregaria, y tras un filtrado se secuencias redundantes basado en la identidad mostrada por las secuencias de L. migratoria, así como la búsqueda de posibles transcritos quiméricos, logramos identificar al menos 42 loci de CSPs de S. gregaria. Mediante una filogenia con CSPs de otros insectos, logramos identificar parejas de CSPs homólogas entre las dos especies de langosta, además de caracterizar sus patrones de expresión mediante análisis de expresión diferencial de datos ómicos. En total, siete parejas de homólogos compartían un patrón de expresión significativo hacia la fase gregaria, una de las cuales (LmigCSP3) está relacionada con la detección de feromonas que propician la agregación, lo que puede indicar que su homólogo (SgreCSP37) pueda tener una implicación en el cambio de fase. Todos los homólogos (tanto intra-específicos como inter-específicos) presentaron indicios de estar bajo selección purificadora. El número de parálogos de CSPs de ambas especies es el mayor reconocido entre los artrópodos con CSPs estudiadas. En conclusión, esta tesis presenta datos y herramientas actualizados para el estudio genético y funcional del cambio de fase en S. gregaria. Los modelos desarrollados en esta tesis servirán para realizar estudios funcionales sobre cómo afectan tratamientos experimentales el grado de agregación. Nuestros transcriptomas nos han permitido identificar una amplia lista de secuencias que pueden estar implicadas en el cambio de fase, además de otras que pueden servir como dianas para insecticidas. Además, nos indican que las rutas genéticas están más afectadas en el sistema nervioso central de la fase gregaria. También nos ha supuesto descubrir varias secuencias de un potencial nuevo agente de control biológico: una gregarina. Toda esta información ha servido incluso para centrarnos en un caso de estudio, por el cual logramos identificar copias únicas de CSPs en dos especies de langosta, así como sus relaciones filogenéticas y sus perfiles de expresión, lo que es un indicio de la conservación de la función de algunas parejas de CSPs homólogas.