Análisis funcional del gen prdx1 mediante su silenciamiento estable por rna interferente en células de hepatocarcinoma humano

Resumen

Esta Tesis Doctoral se ha centrado en la caracterización funcional de la peroxirredoxina 1 (PRDX1). Las PRDXs constituyen una familia de peroxidasas dependiente de tiorredoxina (TXN). Recientemente se le ha atribuido un doble papel como proteína antioxidante y como reguladora de la señalización celular. Con este fin se ha obtenido una línea celular derivada de HepG2 (hepatocarcinoma humano) con la expresión de PRDX1 silenciada de forma estable mediante shRNA (small harpin RNA) una variante de la interferencia por RNA (RNAi). La RNAi se ha convertido en una herramienta esencial en el análisis funcional de genes y está siendo utilizada, en combinación con metodologías ¿ómicas¿ para la identificación de complejas rutas reguladoras en diversos sistemas biológicos. La disminución de la expresión de PRDX1 en la línea HepG2, conllevó una profunda alteración de la morfología, que recuerda a la de células más diferenciadas, así como una disminución de la proliferación celular. Mediante qRT-PCR en tiempo real se analizó el efecto del silenciamiento de PRDX1 sobre la expresión de distintos genes, observándose un incremento en el número de transcritos de genes relacionados con la apoptosis y una disminución de los niveles del mRNA del oncogén FOS y del marcador tumoral ¿-fetoproteína (AFP). Respecto a este último, se ha establecido una correlación lineal entre sus niveles y los de PRDX1. Estos resultados están en consonancia con los niveles anormalmente elevados del transcrito PRDX1 que presentan muestras de tejidos humanos procedentes de hepatocarcinoma y hepatoblastoma. El análisis proteómico puso de manifiesto que la disminución de PRDX1 reduce los niveles de proteínas relacionadas con el metabolismo energético, lo que indica una posible reversión del efecto Warburg, típico de células tumorales. También se vieron afectadas en su expresión proteínas relacionadas con la proliferación celular y apoptosis, la regulación de la transcripción, la traducción de señal y el procesamiento y degradación de proteínas. En cuanto a su papel como antioxidante, el silenciamiento de PRDX1 alteró el estado redox intracelular, disminuyendo el contenido de glutatión total e incrementando la sensibilidad a agentes oxidantes, como el CdCl2. Además, PRDX1 protege a las proteínas de su modificación oxidativa por carbonilación y también afecta a la oxidación reversible de los grupos tioles de los residuos de cisteína presentes en las proteínas. A este respecto, el análisis del subproteoma redox en condiciones normales de cultivo ha permitido identificar proteínas que se relacionan con el metabolismo de glúcidos, lípidos y aminoácidos, proliferación celular, regulación de la transcripción y transducción de señal. Comparativamente, en respuesta a estrés por CdCl2, las proteínas que presentaron una oxidación diferencial a causa del silenciamiento de PRDX1 se encuadraron principalmente en las categorías funcionales procesamiento y degradación de proteínas y defensa antioxidante. En resumen, el silenciamiento estable de la expresión del gen PRDX1 en la línea de hepatocarcinoma humano HepG2 revierte, al menos parcialmente, el carácter tumoral de dichas células, por lo que PRDX1 podría considerarse como un nuevo marcador de hepatocarcinoma y una posible diana terapéutica.