Síntesis y fotofísica del 2,5-dioxopirrolidin-1-il-4-(3-hidroxi-6-oxo-6h-xanten-9-il)-3-metilbenzoato. Aplicación en la detección fluorescente de la hibridación de adn

Resumen

En nuestro grupo de investigación se ha estudiado extensamente la fotofísica de la fluoresceína y de alguno de sus derivados. Además, se ha conseguido aprovechar la sensibilidad de su señal fluorescente frente al pH, para la detección en disolución homogénea de la renaturalización de DNA de E. coli1 y de la hibridación de cadenas complementarias de un c-DNA.2 Recientemente se ha demostrado que es posible disponer de derivados de fluoresceína que se comportan como sondas on/off.3 Estos compuestos poseen una forma disociada (anión) con alto rendimiento cuántico de fluorescencia, mientras que su forma neutra (presente a menor pH) no fluoresce. La disponibilidad de derivados de fluoresceína con rendimiento cuántico de fluorescencia nulo a valores de pH ligeramente ácidos, debe de aumentar la sensibilidad del método anteriormente mencionado para la detección de la hibridación de cadenas complementarias. En este trabajo se ha sintetizado el 2,5 dioxopirrolidin-1-il-4-(3-hidroxi-6-oxo-6H-xanten-9-il)-3 metilbenzoato. Una vez sintetizado, se ha estudiado, mediante espectroscopia de absorción y de fluorescencia en estado estacionario, la sensibilidad a la fuerza iónica del pKa aparente. Seguidamente se ha estudiado, por métodos fluorimétricos en estado estacionario, la reacción de transferencia protónica en el estado excitado (ESPT) mediada por un tampón de fosfatos6. Una vez establecida la existencia de la mencionada reacción en el estado excitado, se ha propuesto un modelo en dos estados excitados y se han recuperado las constantes cinéticas de velocidad que describen el comportamiento dinámico del sistema. Para ello, se ha aplicado la metodología del análisis global compartimental (GCA)4 a la superficie multidimensional de decaimientos de fluorescencia, recogidos en función de la longitud de onda de emisión, pH y concentración de fosfatos. Con los datos fotofísicos necesarios obtenidos, se ha etiquetado el ácido polirribocitidílico, poli(C), como modelo de sonda de RNA y se ha hibridado con ácido polirriboinosínico, poli(I), como diana, al objeto de detectar la reacción de hibridación entre cadenas complementarias5. Se ha realizado así esta investigación, porque los homopolímeros representan el sistema más sencillo para el estudio de las características de la reacción de asociación entre cadenas complementarias. Finalmente, se han efectuado estudios similares con oligonucleótidos de un DNA natural. En lo que a la medida de la señal fluorescente se refiere, se ha hecho tanto por la técnica estándar de espectroscopia de fluorescencia en estado estacionario,5 como mediante la más moderna de espectroscopia de correlación de fluorescencia a nivel de moléculas individuales.