Síntesis y evaluación de inhibidores de las interacciones proteína-proteína mediadas por el dominio PDZ de la NNOSs

Résumé

1. Introducción El óxido nítrico (NO) está involucrado como mediador en los mecanismos de transmisión de señales a nivel del sistema nervioso central y periférico. Sus niveles están regulados fundamentalmente por la isoenzima nNOS . Esta isoenzima posee un dominio PDZ que media las interacciones entre proteínas a través del reconocimiento de secuencias de aminoácidos del extremo carboxilo terminal de otras proteínas. El dominio PDZ de la nNOS reconoce selectivamente secuencias carboxilo terminal del tipo Asp/Glu-X-Val, que pudieran ser de utilidad para bloquear la interacción de la nNOS con el receptor NMDA y evitar así la neurodegeneración mediada por el NO. 2. Objetivos 2.1. Diseño y síntesis de péptidos con afinidad por el domino PDZ de la nNOS. 2.2. Sustitución de la fenilalanina por distintos derivados no naturales al objeto de investigar su influencia en la afinidad hacia el dominio PDZ de la nNOS. 2.3. Sustitución de la prolina por distintos derivados no naturales al objeto de investigar su influencia en la afinidad hacia el dominio PDZ de la nNOS. 2.4. Estudio de la importancia del fragmento N-terminal en el péptido líder. 2.5. Obtención y purificación del dominio PDZ. 2.6. Síntesis de péptidos unidos a distintos transportadores moleculares. 2.7. Determinación de la afinidad de los péptidos obtenidos hacia el dominio PDZ de la nNOS. 2.8. Determinación de la actividad biológica de los péptidos sintetizados en células neuronales. 3. Discusión y resultados El desarrollo de moléculas peptídicas, con variaciones en el número y naturaleza de las secuencias de aminoácidos, sugiere interacciones selectivas con la nNOS. Basándose en este hecho se han desarrollado péptidos que pudieran ser de utilidad para bloquear la neurodegeneración mediada por el óxido nítrico . La síntesis del nonapéptido natural VSPDFGDAV llevada a cabo a través de Síntesis de Péptidos en Fase Sólida, marcado con un fluoróforo, permitió determinar la afinidad por el dominio PDZ, usando técnicas de fluorescencia y de Resonancia Magnética Núclear. Así, se han sintetizado péptidos con variaciones en la secuencia de aminoácidos, unidos a distintos marcadores, sustituyendo la Phe y la Pro por derivados de aminoácidos. Además, se ha llevado a cabo la determinación de la actividad, así como el paso a través de la membrana, sobre células neuronales con péptidos unidos a transportadores moleculares.