Microorganismos halófilos en ambientes salinos de Andalucíaestudio taxonómico numérico y molecular

Resumen

En el desarrollo de la presente tesis doctoral se han utilizado una combinación de técnicas de cultivo microbiológico, métodos de biología molecular y tecnologías de alta resolución para el análisis de lípidos, con el objetivo de conocer la biodiversidad procariota halófila de tres ambientes salinos de Andalucía poco caracterizados hasta el momento, sobre todo a nivel de arqueas, como han sido: las salinas de interior de Fuente de Piedra en Málaga y de La Malahá en Granada, las cuales son de tipo atalasosalina; y las talasosalinas de Santa Mª de Jesús en Bahía de Cádiz. La alta salinidad de estos tres ambientes los hace propicios para hallar microorganismos extremófilos, los cuales son el eje del trabajo. La importancia creciente dada a este grupo de microorganismos, es debida a la capacidad de adaptarse a un medio extremo, los cuales van desde el desarrollo de mecanismos para excluir o desviar el factor que les dificulta la supervivencia hasta coexistir o incluso a depender de él. Estas condiciones le otorgan una serie de caracteres que pueden ser de alta aplicabilidad biotecnológica. OBJETIVOS Los tres ecosistemas salinos reúnen características para ser definidos como ambientes extremos: alta salinidad, variaciones de temperatura y sequedad y presencia de fuentes de agua (mar, surgencias subterráneas y/o superficiales); y permiten el desarrollo y crecimiento de una biota extremófila. De forma específica, los objetivos concretos planteados para el desarrollo del presente trabajo son: I. Describir microbiológicamente los ambientes seleccionados bajo las condiciones estacionales en las que se desarrolló el muestreo. II. Aislar y seleccionar microorganismos halófilos de los ecosistemas salinos localizados en Andalucía basándose en técnicas clásicas de cultivo. III. Realizar un estudio fenotípico de las cepas microbianas seleccionadas. IV. Crear agrupaciones de cepas microbianas por la utilización de la taxonomía numérica y seleccionar representantes de éstas, para su posterior estudio por medio de técnicas moleculares. V. Identificar y clasificar mediante métodos moleculares los aislamientos de halófilos para definir la microbiota de las salinas andaluzas en el momento del muestreo. VI. Analizar el perfil lipídico de nuevas arqueas mediante tecnologías de alta resolución (HTPLC, MALDI-Tof y la combinación de ambas). VII. Describir nuevos taxa de arqueas y/o bacterias halófilas. Mediante estudios polifásicos se han evaluado y caracterizado las cepas asiladas obtenidas de los tres ambientes salinos, generando una descripción y una batería de pruebas nutricionales, de cultivo, morfológicas, bioquímicas, fisiológicas y de susceptibilidad a agentes antimicrobianos, con las que se pudo realizar un análisis taxonómico numérico (Logan, et al., 2009; Oren, et al., 1997; Tindall, et al., 2010). Tras la selección mediante criterios de salinidad principalmente de las cepas de cada uno de los ambientes andaluces, se elaboraron dendogramas a partir de estudios de taxonomía numérica utilizando el coeficiente de agrupamiento simple ¿SM¿ y la técnica de agrupamiento ¿UPGMA¿ (Prado, et al., 1991). Este estudio generó dos dendogramas por ambiente salino estudiado, correspondientes a arqueas y bacterias, donde de las agrupaciones se crearon en función de sus espectros de salinidad y caracteres fenotípicos. Realizada esta clasificación previa, se seleccionó un grupo de arqueas y bacterias con características fenotípicas destacables de cada fenón para comenzar el análisis molecular y filogenético. Los resultados de las secuencias parciales del gen RNAr 16S nos permitió conocer la asignación a taxa de arqueas y bacterias halófilas extremas cultivables que se encuentran en los tres ambientes andaluces estudiados, y así, establecer datos comparativos. El grupo de arqueas se localiza dentro de la familia Halobacteriaceae, siendo descritas especies en los siguientes géneros en la salina de Fuente de Piedra: Halorubrum, Halobellus, Haloterrigena, Haloferax, Halogeometricum, Haloarcula, Halobacterium, Halovivax y Natrinema. En La Malahá se describieron diferentes especies dentro de 5 géneros: Halorubrum, Haloterrigena, Haloarcula, Halobacterium y Natrinema en el caso de las salinas marinas de Bahía de Cádiz fueron descritas especies diferentes de siete géneros: Halorubrum, Haloterrigena, Natrinema, Haloarcula, Haloferax, Halomicrobium y Halorhabdus. Por otro lado, la variabilidad bacteriana fue mayor en cuanto a filos encontrados. En el humedal de Fuente de Piedra, las Proteobacteria (en concreto la clase ¿-Proteobacteria) y los Firmicutes abarcan las especies cultivables aisladas. Se describieron nueve géneros de la atalasosalina de la salina de interior de La Malahá pertenecientes a los filos Proteobacteria (en concreto la clase ¿-Proteobacteria), Bacteroidetes, Firmicutes; y seis géneros de la salina marina de Bahía de Cádiz pertenecientes a los filos Proteobacteria (clase ¿-Proteobacteria) y Firmicutes (Pérez-Davó, et al., 2014, en revisión). En cuanto a los análisis quimiotaxonómicos, realizados a algunos de las más representativas arqueas objeto de estudio, se buscó la descripción detallada del perfil lipídico para una mejor clasificación e identificación de microorganismos. Mediante técnicas de alta resolución como HPTLC y MALDI-Tof (Angelini, et al., 2010; Lopalco, et al., 2013), se detectó una nueva estructura de sulfolípido (bis-sulfatodiglycosildiether) no descrita previamente. Esta estructura puede relacionarse con aquellos lípidos descritos previamente en el perfil de las especies pertenecientes al género Halobellus como lípido no identificado. Asimismo, en base a los datos de taxonomía molecular de la secuenciación completa del gen 16S RNAr, junto con los datos fenotípicos, de contenido de guanina-citosina, quimiotaxonómicos, etc., se observó un grupo de microorganismos con altas probabilidades de contener nuevas especies dentro de géneros ya descritos anteriormente. No obstante, para ser definidas como nuevas especies fue necesario completar los estudios de hibridación DNA-DNA (Ziemke, et al., 1998). Para lo cual se sometieron a una asociación DNA-DNA con el material genético de aquellas especies, válidamente descritas y depositadas en colecciones de cultivo, con las que presentaban mayor similitud a nivel de la secuencia del gen rRNA del 16S. Tras los diferentes análisis de taxonomía numérica, molecular y de quimiotaxonomía, se describieron nuevas especies de arqueas o de bacterias halófilas. Por un lado, una nueva especie bacteriana del género de Alkalibacillus. Esta cepa denominada como S1LM8T fue aislada a partir de sedimentos de la explotación salinera de La Malahá (Granada) y recibe el nombre de Alkalibacillus almallahensis (Pérez-Davó, et al., 2014). Así mismo, se describió una nueva especie de arquea representada por dos cepas procedentes de la laguna del parque natural de Fuente de Piedra, S2FP14T y A1FP7. La especie pertenece al género de Halobellus, y se ha designado como Halobellus ramosii en honor a la contribución realizada en el campo de la microbiología y en especial sobre microorganismos halófilos por el profesor Alberto Ramos-Cormenzana. La arquea A4BC2T aislada en la salina marina de Chiclana de la Frontera en Cádiz fue tipificada como una nueva especie perteneciente al género Halorhabdus. Esta cepa recibió el nombre de Halorhabdus gadibusense debido al ambiente salino del que procedía. CONCLUSIONES Los resultados más importantes de este estudio, pueden resumirse en: 1- Se han aislado y caracterizado un total de 426 cepas microbianas representativas de la diversidad procariota de tres ambientes salinos localizados en distintas provincias andaluzas: Laguna salada de Fuente de Piedra (Málaga); salinas solares de Santa María de Jesús (Cádiz) y salinas de interior de La Malahá (Granada). 2- En los estudios de taxonomía numérica se seleccionaron 91 cepas procedentes de Fuente de Piedra, 76 de La Malahá y 99 de Bahía de Cádiz. Las cepas de arqueas se agruparon en torno al 70% de semejanza, originando 6 fenones para las cepas procedentes de la laguna de Fuente de Piedra, 5 fenones para las aisladas de La Malahá y 7 fenones para las cepas de la Bahía de Cádiz. La población de bacterias, también agrupadas en torno al 70% de semejanza, se distribuyeron en 2 fenones para las procedentes de Fuente de Piedra, 5 fenones para las aisladas de La Malahá y 4 fenones para cepas de las salinas de la Bahía de Cádiz. 3- A partir de los fenones obtenidos por taxonomía numérica, se seleccionaron un total de 65 arqueas y 37 bacterias para realizar los estudios de taxonomía molecular. Procedentes de la Laguna salada de Fuente de Piedra, 30 eran arqueas y 6 bacterias; de las salinas de interior de La Malahá, 16 eran arqueas y 19 bacterias; y procedentes de las salinas solares de la Bahía de Cádiz, 19 eran arqueas y 12 bacterias. 4- La diversidad de arqueas es similar en los tres ambientes salinos estudiados y está representada por los géneros Halorubrum, Haloterrigena, Haloarcula y Natrinema. En relación a las bacterias, los géneros que se encuentran en los tres ambientes estudiados son: Halomonas, Salicola, y Halobacillus. 5- De forma particular, en cada ambiente salino estudiado se han encontrado géneros específicos, resaltando la presencia de la arquea Halobellus en Fuente de Piedra y Halorhabdus en Bahía de Cádiz. De igual forma, destaca la presencia de las bacterias Paraliobacillus, Idiomarina y Virgibacillus en Fuente de Piedra; Alkalibacillus, Halospina, Salinibacter y Salinococcus en La Malahá; y Thalassobacillus en Bahía de Cádiz. 6- La salina de Fuente de Piedra destaca como el ambiente con mayor biodiversidad en el dominio de arqueas, formada por nueve géneros distintos dentro de la familia Halobacteriaceae. Las salinas de interior de la Malahá sobresalen por la mayor variabilidad en el dominio bacteriano, presentando nueve géneros localizados en los filos: ¿-Proteobacteria, Bacteroidetes y Firmicutes. 7- El perfil lipídico de dos cepas pertenecientes al género Halobellus, obtenido mediante las técnicas HPTLC y MALDI-Tof, han definido una nueva estructura lipídica no descrita previamente, el bis-sulfato-diglicosil-diether (S2-DGD). 8- El presente trabajo ha llevado, hasta el momento, a la descripción de tres nuevas especies: Alkalibacillus almallahensis sp. nov., bacteria halófila procedente del sedimento de la salina de interior de La Malahá. Halobellus ramosii sp. nov., arquea halófila extrema aislada del agua y sedimento de Fuente de Piedra. Halorhabdus gadibusense sp. nov., arquea halófila extrema aislada del agua de la salina marina de Santa Mª de Jesús, Chiclana de la Frontera de la Frontera.