Análisis de los cambios de expresión génica asociados a la presencia de cromosomas b en el saltamontes eyprepocnemis plorans

Resumen

Los cromosomas B y el conjunto de cromosomas estándar (A) experimentan una sucesión en el tiempo y en el espacio de diferentes relaciones coevolutivas, caracterizadas por la existencia de mecanismos de acumulación de los cromosomas B y la respuesta del hospedador para suprimir estos mecanismos y neutralizar los efectos deletéreos de los Bs. El saltamontes Eyprepocnemis plorans presenta un sistema de cromosomas B muy polimórfico, con más de 50 variantes descritas. En la Península Ibérica, las principales variantes de cromosoma B (B1, B2 y B5) se encuentran en un estadio de evolución neutra o cercana a la neutralidad, sin mecanismos aparentes de acumulación, como resultado de esta coevolución con el hospedador. La aparición, en los años ochenta, de la variante B24 en la población española de Torrox (Málaga), derivada del B2, y que mostraba tasas de transmisión superiores a las mendelianas, evidenció la capacidad de regeneración de los mecanismos de acumulación de los cromosomas B. De esta forma, las acciones antagonistas de los cromosomas parásitos y el genoma estándar, que se reflejan en esta dinámica evolutiva, sugieren la existencia de una interacción al nivel molecular, probablemente durante la expresión génica. Es aquí donde reside el principal objetivo de esta Tesis Doctoral, en la que trataremos de averiguar si los cromosomas B de esta especie contienen genes que codifican para proteínas, si están activos y si alteran los patrones de expresión génica del genoma hospedador, ya sea en respuesta a su mera presencia o a los productos génicos de los cromosomas B. En primer lugar, hemos comprobado que la presencia de cromosomas B no provoca una mayor tasa de dobles roturas y reparación de ADN, pero hemos observado que la proteina Ku70, implicada en la reparación no homóloga del ADN, muestra un comportamiento único en E. plorans al localizarse en la región centromérica de todos los cromosomas mitóticos y meióticos (incluido el cromosoma B) durante metafase y anafase. Mediante inmunofluorescencia combinada con tratamientos con colchicina y ARN de interferencia, demostramos que la presencia de Ku70 en los centrómeros tiene relación con la función centromérica, ya que los foci centroméricos desaparecían con estos dos tratamientos y ello estaba asociado al aumento en la frecuencia de espermátidas poliploides, lo que sugiere que la citocinesis en esta especie requiere la presencia de Ku70 en los centrómeros. Esta nueva función para esta proteína parece ser una autapomorfía en E. plorans, puesto que no se observaron foci centroméricos en otras catorce especies de saltamontes ni en el ratón. No encontramos, sin embargo, ninguna evidencia de que esta función estuviera asociada con la presencia de cromosomas B en esta especie. Entre los efectos de los cromosomas B, conocidos previamente en E. plorans, destaca el descenso de los niveles de proteína del estrés Hsp70 en gónadas de machos y hembras portadores de cromosomas B, que parecía tener alguna relación con el grado de parasitismo de los cromosomas B, ya que el efecto era dependiente de la dosis (es decir, del número de Bs) y del estado de neutralización de los mismos, ya que el descenso era más acusado para la variante B24 (en Torrox, Málaga) que para la variante B2 (en Salobreña, Granada), variantes que se encuentran en estado parasítico y neutralizado, respectivamente. Uno de los objetivos propuestos en esta Tesis Doctoral fue averiguar si este descenso en los niveles de Hsp70 se observa ya al nivel transcripcional o bien tiene su origen en una regulación post-transcripcional. Para abordarlo, analizamos, mediante PCR cuantitativa (qPCR), los niveles de transcripción del gen Hsp70 en 80 machos y hembras de estas mismas dos poblaciones, tanto en gónadas como en el resto del cuerpo, en su conjunto. La ausencia de diferencias significativas entre individuos portadores y no portadores de cromosomas B, en casi todas las muestras, sugiere que el descenso en Hsp70, asociado a la presencia de cromosomas B, no se debe a cambios en la actividad transcripcional del gen sino a mecanismos de regulación post-transcripcionales, un hecho que parece ser frecuente en poblaciones expuestas a un estrés continuado. El carácter predominantemente heterocromático de los cromosomas B, y la gran cantidad de ADN repetitivo que acumulan, han hecho creer durante años que los cromosomas B son elementos transcripcionalmente inertes. También se asumía que estos cromosomas no portaban secuencias génicas debido al característico proceso de degeneración que sufren por la ausencia de recombinación con los cromosomas A. Sin embargo, en los últimos años, las nuevas técnicas de secuenciación de alto rendimiento han permitido identificar la presencia de genes que codifican para proteínas, o versiones pseudogénicas de éstos, en los cromosomas B de algunas especies, revelando incluso su transcripción activa en algunos casos. Con el fin de obtener pruebas adicionales sobre este interesante aspecto de la investigación sobre los cromosomas B, hemos realizado una búsqueda de genes para proteínas en el cromosoma B24 de E. plorans, mediante el mapeo de secuencias Illumina de ADN genómico, procedentes de un macho 0B y otro 4B de Torrox, sobre las secuencias codificadoras extraídas de un transcriptoma ensamblado de novo con lecturas de ARNseq realizado en esta misma población. El análisis comparativo de la cobertura diferencial en 0B y 4B reveló la presencia de, al menos, nueve genes para proteínas en el cromosoma B24 de E. plorans, que validamos posteriormente mediante qPCR al demostrar ésta que la abundancia genómica de estos genes aumentaba linealmente con el número de cromosomas B. Cuatro de estos genes (CIP2A, GTPB6, KIF20A y MTG1) mostraron su secuencia completa en el genoma 4B, mientras que los cinco restantes (CKAP2, CND3, HYI, MYCB2 y SLIT) estaban truncados. El análisis de las lecturas de RNAseq de dos hembras de Torrox, una 0B y la otra 1B, y la subsiguiente confirmación por qPCR, mostró que cinco de ellos (dos completos y tres truncados) estaban sobre-expresados proporcionalmente al número de cromosomas B, tanto en gónadas como en el resto del cuerpo de machos y hembras, tal como se esperaría si el cromosoma B estuviera transcribiendo activamente estos genes. De hecho, los tres genes truncados (CKAP2, CND3 y MYCB2) no mostraban esta sobrexpresión cuando la qPCR se realizaba con cebadores que anclaban en las regiones ausentes del cromosoma B. Por tanto, nuestros resultados demuestran que los cromosomas B de E. plorans no están tan silenciados como se creía hasta ahora. Cabe destacar que los cinco genes del cromosoma B que se transcriben, dos completos (CIP2A y KIF20A) y tres truncados (CKAP2, CND3 y MYCB2) se han asociado con funciones potencialmente cruciales para la transmisión del cromosoma B, tales como la segregración y estabilidad cromosómicas, la citocinesis y el ensamblaje de los microtúbulos en la transición metafase-anafase. En conjunto, estos resultados permiten hipotetizar que el éxito evolutivo de los cromosomas B en esta especie se debe a su contenido génico. Una vez demostrada la presencia de genes para proteínas en el cromosoma B, nos interesó averiguar la posible funcionalidad de los transcritos codificados por uno de esos genes, concretamente el gen que codifica para la subunidad CAP-G de la condensina I. La hibridación in situ fluorescente mediante amplificación de la señal con tiramidas (FISH-TSA), ha permitido visualizar la presencia de varias copias en tandem localizadas en la región distal del cromosoma B24. Hemos comprobado mediante qPCR, que hay también varias copias truncadas de este gen en el cromosoma B de la población de Salobreña, que es la variante B2. Además, en ambas poblaciones (Torrox y Salobreña), hemos observado la transcripción activa de la variante pseudogénica de CAP-G situada en el cromosoma B, pero esta sobre-expresión no afectaba a la expresión de los genes que codifican para las subunidades CAP-D2 y CAP-D3 de la condensina I y II, respectivamente. Esto indica que el exceso de transcritos de CAP-G procedente de los cromosomas B no está aumentando la actividad general de las condensinas. Por último, discutimos los posibles efectos, a varios niveles, del exceso de transcritos pseudogénicos. Finalmente, nos interesaba averiguar cuál es la respuesta del genoma hospedador a la presencia de cromosomas B que transcriben al menos parte de su contenido génico. Mediante ARNseq y microarrays realizados en hembras con y sin cromosomas B de Torrox y Salobreña, respectivamente, hemos obtenido algunas respuestas a esta pregunta. En total, observamos 188 unigenes que mostraban cambios de expresión en el mismo sentido con ambas técnicas de análisis y, por tanto, en ambas poblaciones. Descartando los cambios que podían deberse a la expresión de los genes localizados en el cromosoma B, encontramos 46 genes que codifican para proteínas conocidas, cuyos cambios de expresión podrían estar relacionados con la adaptación del genoma hospedador a la presencia del cromosoma parásito. Estos cambios de expresión tenían relación con algunos de los efectos más conocidos de los cromosomas B, tales como los efectos nucleotípicos derivados de la presencia del ADN adicional que aportan los cromosomas B, la defensa química y la detoxificación, la modificación de proteínas, la respuesta al estrés, la función ovárica y la regulación de la expresión génica. Además, encontramos, asociado a la presencia de cromosomas B, un incremento en la expresión de muchos elementos transponibles, que era paralelo a la represión del gen Dicer1, y que podemos interpretar como un incremento en la actividad de éstos en presencia de cromosomas B, debido al debilitamiento de la defensa contra los elementos transponibles que proporciona Dicer1 a través de ARN de interferencia. En conjunto, los resultados de esta Tesis Doctoral han conseguido elucidar nuevos detalles de la relación entre los cromosomas A y B en Eyprepocnemis plorans, sugiriendo la interesante posibilidad de que el secreto del éxito de los cromosomas B resida en su contenido génico, su capacidad para transcribirlo y, por tanto, su habilidad para evitar el silenciamiento por parte de los cromosomas A. Esto convierte a los cromosomas B en verdaderos parásitos intragenómicos en íntima interacción transcripcional con el genoma hospedador, una visión completamente nueva para estos interesantes y enigmáticos elementos genómicos. Supernumerary (B) and standard (A) chromosomes undergo a spatiotemporal succession of coevolutionary relationships characterized by the existence of accumulation mechanisms (drive) for B chromosomes and a variety of A chromosome responses directed toward drive suppression and diminish harmful effects. The grasshopper Eyprepocnemis plorans shows a very polymorphic system of B chromosomes, as more than 50 variants have been hitherto described. As a result of their coevolutionary interaction with A chromosomes, the main variants of B chromosomes in the Iberian Peninsula (B1, B2 and B5) have been neutralized and thus lack apparent drive. However, a new variant (B24) arisen in the Spanish population of Torrox (Málaga), derived from B2, still showed drive when analyzed in the eighties. The appearance of this new variant proved the ability of these B chromosomes to recuperate drive mechanisms which had been lost in the ancestor neutralized B chromosome. The antagonistic relationship between the parasitic chromosomes and the standard genome is revealed by their coevolutionary dynamics, and suggests the existence of an interaction at molecular level, probably through gene expression changes. At this point lies the main objective of the present PhD Thesis. Specifically, we will try to find out whether B chromosomes in this species harbor protein-coding genes, whether they are actively transcribed and whether they alter the expression of the genes located in the host genome, either in response to mere B presence or as consequence to B chromosome gene products. First, we have observed that the presence of B chromosomes is not associated with higher levels of double strand breaks and repair, but we incidentally observed that the Ku70 protein, which is involved in the non-homologous end joining pathway of DNA repair, localizes in the centromeric region of all A and B chromosomes during mitosic and meiotic metaphase and anaphase, but this is a feature unique for E. plorans. By means of inmunofluorescence, we showed that Ku70 presence at centromeres is related with centromeric function, as the disappearance of the Ku70 foci from centromeres, after colchicine and interference RNA treatments, was associated with an increased frequency of polyploid spermatids, suggesting that Ku70 centromeric presence is required for cytokinesis in this species. This novel function for the Ku70 protein is an autapomorphy in E. plorans, as we did not observe centromeric foci in other fourteen grasshopper species or the mouse. Nevertheless, we did not find any evidence for the association between this function and the presence of B chromosomes in this species. Among the previously known B chromosome effects in E. plorans, we can highlight the descent of cellular levels for the Hsp70 stress protein in gonads of B-carrying males and females. This effect appeared to be related with the parasitic degree of B chromosomes, as it depended on the number of B chromosomes and also on their evolutionary stage, as the descent was more marked for the parasitic B24 variant (from Torrox, Málaga) than for the neutralized B2 (from Salobreña, Granada). One of the objectives in this PhD Thesis was to find out whether this decrease in Hsp70 levels occurs at transcriptional level, or else is due to post-transcriptional regulation processes. To address this objective, we analyzed, by means of qPCR, the Hsp70 gene expression levels in 80 males and females from the same two populations mentioned above, in gonads and in the somatic body. The absence of significant differences between B-carrying and B-lacking individuals in almost all samples analyzed suggests that the descent of Hsp70 protein levels associated to B chromosome presence is not due to changes in the transcriptional activity of the gene, but to mechanisms of post-transcriptional regulation, a pattern that seems to be usual in populations submitted to a continuous source of stress. The heterochromatic nature of B chromosomes and the high amounts of repetitive DNA they accummulate, have led researchers to believe that B chromosomes are transcriptionally inert. Furthermore, a typical feature of B chromosomes is that they do not recombine with A chromosomes, which leads them towards a process of chromosome degeneration. Therefore, it was assumed for long that B chromosomes do not harbor gene-derived sequences. However, during the last decade, the development of new high throughput sequencing techniques have allowed the identification of protein-coding genes, or pseudogenized copies, in the B chromosomes of some species, revealing even active transcription in some cases. Aiming to obtain additional evidence about this attractive facet of B chromosome research, we performed a search for protein-coding genes in the B24 chromosome of E. plorans, by means of Illumina sequencing of DNA and RNA. We thus sequenced genomic DNA from one 0B and one 4B males collected at Torrox, and obtained two libraries of Illumina reads which were mapped on a set of coding sequences, from a de novo transcriptome resulting from the assembling of RNAseq reads obtained from 0B and 1B females from this same population. The comparative analysis of differences in coverage for 0B and 4B libraries revealed that at least nine protein-coding genes are located in the B24 chromosome of E. plorans. All of them were validated by means of qPCR, showing that the genomic abundance of these genes increased linearly with the number of B chromosomes. Four of these genes (CIP2A, GTPB6, KIF20A y MTG1) showed a complete coding sequence (CDS) in the 4B genome, whereas the five remaining (CKAP2, CND3, HYI, MYCB2 and SLIT) were truncated. Mapping the RNA reads from the 0B and 1B females, on the same reference transcriptome, revealed that five of the former genes (two complete and three truncated) showed significant up-regulation which was proportional to the number of B chromosomes, in both gonads and bodies from males and females, as expected if that transcripts came directly from active expression of those genes. Indeed, in the case of truncated genes, we did not find differential expression when the qPCR was carried out with primers anchoring on the regions that were absent from the B chromosome. Therefore, our results demonstrate that B chromosomes in E. plorans are not so silenced as was hitherto believed. It is interesting to emphasize that the five genes that are actively transcribed, two complete (CIP2A and KIF20A) and three truncated (CKAP2, CND3, and MYCB2) are associated with functions being potentially crucial for B chromosome transmissions, such as chromosome segregation and stability, cytokinesis and microtubule assembly in metaphase-anaphase transition. As a whole, this result leads to hypothesize that the evolutionary success of B chromosomes in this species is a consequence of its genomic content and the ability to avoid silencing mechanisms of the host. Once the presence of protein-coding genes in the B chromosome was demonstrated, we were interested in finding out the possible functionality of the transcripts coded by one of these genes, specifically the gene coding for the condensin complex CAP-G subunit. We compared the aminoacid sequence of CAP-G from many organisms, and determined that the predicted protein coming from the transcripts yielded by the B chromosome would show at least two changes becoming it probably non-functional, and that the CAP-G gene copies in the B chromosome are pseudogenic. Fluorescence in situ hybridization with tyramide signal amplification (FISH-TSA) allowed to visualize the B-CAP-G pseudogene as several tandemly repeated copies located in the distal region of the B24 chromosome. By means of qPCR, we showed that, in two Spanish populations (Salobreña and Torrox, with B2 and B24 variants, respectively), the B-CAP-G pseudogene is actively transcribed, without apparent correlation with the expression of CAP-D2 and CAP-D3 subunits of condensin I and II, respectively. This indicates that the B chromosome transcripts are not enhancing the activity of the condensin complex. Possible effects of the B-CAP-G transcripts at several levels are discussed. Finally, we were interested in finding out details on how the host genome responds to the presence of a B chromosome being able to transcribe part of its genetic content. By means of RNAseq and microarrays performed in females with and without B chromosomes from Torrox and Salobreña, respectively, we got some answers to this topic. We identified a total of 188 unigenes showing gene expression changes in the same direction for both techniques, and thus in both populations. Discarding changes that could be due to the expression of the genes located in the B chromosome, we found 46 known protein-coding genes, whose expression changes might be associated with the adaptation of the host genome to the presence of a parasitic chromosome. These gene expression changes were related to some of the most known effects of B chromosomes, such as nucleotypic effects (i.e., effects derived from the increase in DNA amount due to the presence of the extra chromosomes), chemical defense and detoxification, protein modification and turnover, stress response, ovarian function and gene expression regulation. Moreover, we found, associated to the presence of B chromosomes, an increment in the expression of a high number of different transposable elements, which was parallel to the decrease on the expression of the Dicer1 gene. We interpret this as a signal of increased transpositional activity in the presence of B chromosomes, derived from a weaker defense against transposable elements throught RNAi caused by Dicer1 down-regulation. As a whole, the results of this PhD Thesis have untangled new details about the transcriptional relationship between B and A chromosomes in Eyprepocnemis plorans, suggesting the interesting possibility that the secret of the evolutionary success of B chromosomes may lie on their genetic content and their ability to avoid the mechanisms of silencing developed by the host, in order to transcribe their gene content. This results transform the current paradigm of B chromosomes and become them into true intragenomic parasites being in an intimate relationship at transcriptional level with the host genome, and providing new insights for future research on these interesting and enigmatic genomic elements.