Estudio clínico-epidemiológico de enterovirus nopolio y optimización del cultivo celular

Resumen

En primer lugar se realizó el estudio clínico-epidemiológico de la infección por enterovirus en el área de Granada. Se recogieron datos clínicos y demográficos de los pacientes detectados y, por otro, fueron caracterizados a nivel de serotipo todos los enterovirus aislados en el Laboratorio de Microbiología del Hospital Virgen de las Nieves (Granada) durante el período 1986-2006. La serotipificación de los enterovirus se realizó mediante diversas técnicas: (a) Inmunofluorescencia indirecta (IFI), (b) Secuenciación de la región VP1, (c) Neutralización del crecimiento con antisueros específicos. El análisis de los datos nos mostró que las infecciones por enterovirus se producen en este área a lo largo de todo el año. Además hubo algunos años de especial actividad enterovirual, 1991, 2000 y 2006. Otro rasgo de la enfermedad por enterovirus es que la afectación neurológica se produce fundamentalmente en niños varones menores de 9 años, mientras que la infección sin afectación del SNC se da principalmente en pacientes menores de 4 años. A lo largo de los 20 años estudiados se detectaron 29 serotipos diferentes de enterovirus asociados a infección en nuestro medio. Algunos como echovirus (E) 30, E6, E9 y coxsackievirus (CV) B5 son endémicos en nuestro área y su incidencia aumenta cíclicamente cada 3-4 años, mientras que E13 ó E4 han aparecido de forma importantes en momentos puntuales. En la vigilancia epidemiológica realizada se detectó por primera vez la presencia en esta región de enterovirus (EV) 75 en 5 pacientes, constituyendo esta la mayor serie de infección por este serotipo descrita hasta la fecha. Los ensayos de optimización del cultivo celular se reaizaron vaciando el crecimiento en distintas líneas celulares de 31 seorotipos distintos de enterovirus (E1, E3-7, E9, E11, E13-14, E17-18, E20-21, E24-25, E30, E33, CVA4, A9, A16, A24, B1-6, EV69, EV71, EV75). Las líneas celulares evaluadas fueron: RD, MRC-5, Vero, Casco-2 y NCI-H292. La evaluación del crecimiento de los diferentes serotipos en cada línea celular se realizó de 3 formas: (a) valorando la producción de efecto citopático a lo largo de 10 días de incubación, (b) cuantificación de focos fluorescentes en shell vial tras 24h y 48h de incubación, (c) semicuantificación mediante PCR a tiempo real del sobrenadante de shell vial tras 24h y 48h de incubación. Estos ensayos indicaron que el uso conjunto de células RD y Caco-2 constituía la manera más eficaz de detectar todos los serotipos de enterovirus en ensayados. Por otro lado la aplicación de la RT-PCR del sobrenadante del cultivo fue el procedimiento más sensible de los empleados para la detección de enterovirus. Y se concluyó que todos los cultivos realizados para el diagnóstico de infecciones por enterovirus deben ser evaluados al final del protocolo de incubación establecido mediante IFI o preferiblemente RT-PCR, incluso aunque no se produzca ningún efecto citopático en el mismo.