Diseño y desarrollo de un nuevo sistema de tipaje hla genómico"paseo alélico"

Resumen

El objetivo de esta tesis doctoral fue elaborar y optimizar un sistema de tipaje hla genomico de alta resolucion y fiabilidad, adecuado, fundamentalmente, para uso hospitalario. La unidad metodologica basica utilizada fue la amplificacion mediante pcr y posterior digestion con enzimas de restriccion. El sistema diseñado, denominado paseo alelico, se basa en la propiedad de las endonucleasas de separar alelos positivos para un determinado polimorfismo de aquellos que son negativos; tras electroforesis el fragmento digerido es recuperado del gel reamplificado y reanalizado en otro sitio polimorfico. De esta forma, tras un numero variable de rondas de pcr-digestion, se establece el ligamiento en cis de varios polimorfismos, lo que conduce a la asignacion inequivoca de cada alelo en una muestra. Para detectar sitios polimorficos no reconocidos por las endonucleasas disponibles se utilizo la estrategia de creacion de sitos de restriccion en el proceso de amplificacion (acrs). La viabilidad de la estrategia fue evaluada para dos grupos de genes hla, (drb1*04 y hla-b*27). Los resultados fueron satisfactorios, demostrandose la capacidad del sistema para definir todos los alelos de cada grupo de forma inequivoca. La estrategia de paseo alelico se ha mostrado como un sistema de tipaje de alta resolucion y fiabilidad, a la vez que flexible y economico y con la posibilidad de ser estandarizado entre diferentes laboratorios. Todo ello lo convierte en un metodo alternativo a los previamente existentes, valido y asequible para su uso en medio hospitalario.