Metilación del promotor de la enzima mgmt (o6-metilguanina-dna metiltransferasa) y expresión de mgmt y cd133 como marcadores pronósticos en pacientes con glioblastoma multiforme tratados con temozolamida y radioterapia

Resumen

El glioblastoma multiforme (GBM) representa el glioma más agresivo en la población adulta y es una enfermedad rápidamente progresiva con una mediana de supervivencia global inferior a un año. La determinación de la metilación del promotor del gen de la enzima metil-guanina-O6-DNA metiltransferasa (MGMT) tiene impacto pronóstico. Los fármacos más utilizados en neuro-oncología (nitrosureas, temozolamida, procarbazina) deben su efectividad a la lesión metiladora que producen sobre el ADN. La enzima de reparación metilguanina-O6-metiltransferasa (MGMT) repara el ADN a través de la eliminación directa de un grupo alquilo del átomo O6 de la guanina en el ADN de las células expuestas a agentes alquilantes. Uno de los mecanismos epigenéticos de inactivación génica consiste en la metilación aberrante de la citosina presente en las islas CpG de los promotores génicos. Si el promotor del gen de la enzima MGMT se encuentra metilado, el gen es silenciado y no se produce proteína reparadora; con lo que la lesión producida por la quimioterapia en la célula tumoral se convierte en irreversible y la célula entra en apoptosis. Diversos estudios han analizado el impacto del estatus de metilación del promotor del gen de MGMT, encontrando que tiene valor pronóstico y predictivo de respuesta a agentes alquilantes. En base a la dificultad técnica que supone la implantación en los Centros de la tecnología de MSP, se ha intentado determinar la expresión proteica de MGMT por inmunohistoquímica y establecer las diferentes correlaciones pronosticas, siendo los resultados muy controvertidos. Las últimas investigaciones muestran que son tumores que derivan de una célula madre troncal pluripotencial con características fenotípicas y genotípicas de célula madre (Cancer Stem Cell, CSC), lo que le confiere una elevada resistencia a los tratamientos. Las células madre formadoras de gliomas (Glioma Stem Cell, GCS) suponen una pequeña fracción del total de las células que componen el tumor y se caracterizan por poseer una proteína de superficie denominada CD133, especulándose sobre la posibilidad de que CD133 pueda ser un marcador molecular que nos ayude a saber con más exactitud el pronóstico de estos pacientes y seleccionar su tratamiento óptimo. En este trabajo se aplican en muestras clínicas de pacientes con glioblastoma multiforme, técnicas de biología molecular y de inmunohistoquímica, con el objeto de confirmar el valor de marcadores pronósticos establecidos en nuestro propio grupo de pacientes y avanzar en la determinación de nuevos marcadores pronósticos o predictivos de respuesta al tratamiento de los glioblastomas multiformes. Uno de los objetivos principales de nuestro estudio fue estandarizar la técnica de determinación de metilación mediante PCR específica de metilación (MSP), tras la realización de múltiples protocolos de extracción de ADN en muestras incluidas en parafina se encontró el protocolo que permitió obtener los mejores resultados en cuanto a ratio y concentración. Aplicamos dicho protocolo a las muestras de GBM y confirmamos que la metilación de MGMT es factor pronóstico de supervivencia y factor predictivo de respuesta al tratamiento con radioterapia y temozolamida. Posteriormente procedimos a analizar la expresión de MGMT mediante inmunohistoquímica en nuestras muestras. No encontramos impacto pronóstico en la expresión de MGMT en GBM y tampoco hubo una correlación significativa entre metilación y nivel de expresión de MGMT, lo que apoya la hipótesis de que la regulación de la expresión de esta enzima es un sistema extremadamente complejo que queda por dilucidar. También analizamos la expresión de CD133 por inmunohistoquímica como marcador de las GCS y su impacto pronóstico. En el estudio global de los pacientes con GBM, la expresión de CD133 no fue factor pronóstico de supervivencia ni factor predictivo de respuesta al tratamiento. No obstante, cuando se analizó de forma independiente el subgrupo de pacientes pertenecientes al Hospital Virgen de las Nieves de Granada, la expresión de CD133 si alcanzó la significación estadística en supervivencia global, que fue de 13 meses en los pacientes con baja expresión (+) frente a 20 meses en los pacientes con alta expresión (++/+++) (p=0.05). Este dato viene a contradecir lo observado en otros estudios en los que la alta expresión es un factor adverso o bien no tiene efecto sobre la supervivencia y viene a sumarse a la hipótesis de que el papel de CD133 como marcador pronóstico es discordante. Por otra parte, la determinación de otros marcadores moleculares como Ki-67 y p53, no mostraron significación pronostica en nuestro grupo de pacientes. Finalmente el estudio con un grupo de pacientes reintervenidos por progresión de la enfermedad tras el tratamiento con radioterapia y temozolamida, mostró resultados que, aunque limitados por el número de pacientes analizados, apuntan hacia una posible incidencia del propio tratamiento sobre la metilación del promotor de MGMT y CD133. Serán necesarios más amplios estudios para confirmar esta hipótesis. Por tanto, en nuestro estudio se confirma el valor pronóstico y predictivo de respuesta de la determinación de la metilación de MGMT mediante MSP, mientras que el papel de otros posibles marcadores pronósticos determinados por técnicas de inmunohistoquímica permanece sin aclarar.