Valoración de protocolos de diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón hacia endodermo pancreático mediante el análisis de poblaciones celulares que expresan marcadores característicos

Resumen

Transgenes, diferenciación y selección celular. Los procesos de diferenciación espontáneos en monocapa o en los cuerpos embrionarios en ausencia de LIF son impredecibles, aunque existe una cierta tendencia en monocapa hacia una mayor proporción de células de linaje ectodérmico, lo que dificultaría la obtención de precursores de otros linajes. Estudios anteriores han utilizado diferentes aproximaciones para la selección de determinados precursores que pueden ser finalmente madurados a células diferenciadas, que remedan las funciones de las correspondientes de tejidos adultos: cardiomiocitos. Precursores neuronales, precursores hematopoyéticos, osteoblastos. Nuestro laboratorio obtuvo varios clones de células productoras de insulina a partir de células embrionarias de ratón de la línea comercial R1, utilizando una tecnología de selección mediante la expresión de un transgen, previamente incorporado en las células, conteniendo un factor de resistencia a neomicina (gating technology) bajo la regulación del promotor de un gen expresado en las células que queremos seleccionar, el promotor de la insulina en nuestro caso. Las células seleccionadas fueron maduradas de tal manera que fueron capaces de liberar insulina en respuesta a glucosa. Los clones implantados permitieron reducir los niveles de glucosa y la mortalidad de ratones diabéticos. Uno de los principales inconvenientes de esta y de otras selecciones es la baja proporción de clones que se obtienen, debido a que el número de células precursoras que se obtienen en los procesos de diferenciación son bajos. Uno de los principales objetivos de la ingeniería celular que persigue obtener tejidos de células embrionarias es la de favorecer los procesos de diferenciación hacia linajes concretos que permita direccionar de una forma más efectiva la obtención de células especializadas con potencial utilidad clínica, desde neuronas, hasta células endocrinas. Es por ello imprescindible conocer los procesos de diferenciación de estas células in vitro y los mecanismos que permiten su control. Una de las herramientas mas importantes utilizada recientemente en biología es la proteína verde fluorescente (GFP) clonada de medusas bioluminiscentes y que permite visualizar los procesos celulares y la expresión de proteínas. Este gen ha sido utilizado en diferentes construcciones genéticas bajo control de diferentes promotores cuya activación puede ser seguida por la consiguiente expresión de la proteína y la emisión fluorescente. El objetivo de este trabajo es el de utilizar esta tecnología para estudiar el proceso de diferenciación en líneas de células embrionarias de ratón y poder seleccionar células precursoras de linaje endodérmico capaz de madurar con alto rendimiento a células productoras de insulina. Para llevar a cabo este objetivo se ha iniciado recientemente el diseño y la obtención de un primer constructo para la selección de células indiferenciadas conteniendo la GFP bajo el control del promotor del factor de transcripción denominado Oct-4 que solo se expresa en las células indiferenciadas de la masa celular interna, así como en las células precursoras de la línea germinal. (Ku, H.T., et al., 2004) Objetivos concretos antecedentes y metodología El presente proyecto abarca tres objetivos relacionados con el proceso de diferenciación in vitro de células embrionarias de ratón, utilizando constructos conteniendo la proteína verde fluorescente como indicador así como diferentes condicionantes en el cultivo in vitro que dirijan la diferenciación hacia el endodermo definitivo, origen embrionario de las células productoras de insulina del páncreas (célula beta). El primero pretende caracterizar métodos de selección de precursores de linaje endodérmico definitivo, el segundo la selección de células productoras de insulina mediante transgenes específicos y el tercero pretende la identificación de factores de diferenciación en medios condicionados que puedan ayudar a una selección más eficaz. 1.- Primer objetivo: Estudio comparativo del proceso de diferenciación con células en el mismo pase y de igual potencial teórico, utilizando clones de células verdes indiferenciadas (alto contenido en Oct-4) frente a clones sin fluorescencia correspondientes presumiblemente a células en proceso de diferenciación cuyo linaje ya pueda estar condicionado. Este paso es crucial debido a la importancia que tienen las células residuales con alta expresión de Oct-4 tras los procesos de diferenciación, en terapia tisular, debido a que son las causantes de la producción de teratomas a causa de anomalías en el cariotipo, como hemos podido comprobar en nuestra unidad de investigación. En vista de los interesantes resultados obtenidos se pasó a publicar un artículo (Enseñat-waser, R. et al., 2006). 2.- Segundo objetivo: Constructos de selección de células productoras de hormonas pancreáticas El segundo objetivo concreto considerado es el de diseñar, obtener y emplear construcciones genéticas conteniendo la proteina verde fluorescente o de resistencia a antibióticos bajo control de genes implicados en la aparición de células productoras de hormonas pancreáticas, incluyendo el promotor de la propia insulina o glucagón, así como el promotor de genes que aparecen en el desarrollo temprano de células de endodermo definitivo como alfa-fetoproteina o tardío del páncreas endocrino como neurogenina-3. Aprovechando los resultados planteados en el primer objetivo se transfectarán células con estas construcciones y se seleccionarán clones (fluorescentes o resistentes) de células comprometidas hacia la diferenciación de células de origen endodérmico (alta expresión de alfa-fetoproteina). Los procesos de maduración con nicotinamida o activina o de selección coaxial con medios condicionados y/o definidos permitirán evaluar mediante la aparición de fluorescencia y expresión de otros indicadores (PCR), posibles precursores de células pancreáticas productoras de hormonas pancreáticas. Estas células pueden ser aisladas mediante citometria de flujo estudiadas y cultivadas. La posible secreción regulada de insulina en estas células será evaluada en todos los clones aislados. 3.-Tercer objetivo: Identificación de factores de diferenciación. Se ha demostrado que las propias células embrionarias, cuando inician procesos de diferenciación en los cuerpos embrionarios, inducen la diferenciación de células vecinas, bien mediante interacción célula-célula o bien por la liberación de factores aún por caracterizar. La presencia de indicadores fluorescentes del proceso de diferenciación bien por eliminación de fluorescencia (Oct4-GFP: objetivo 1), como de aparición de fluorescencia en caso de linaje endodérmico (AFP-GFP: objetivo 2) nos permite la posible evaluación de sustancias activas en los medios condicionados estudiando la evolución de fluorescencia en cultivos seleccionados. Medios condicionados de cuerpos embrionarios serán concentrados mediante membranas selectivas y la fracción proteica resultante junto con los oportunos controles de medios sin condicionar serán fraccionadas mediante diferentes aproximaciones cromatográficas (filtración en gel, HPLC). La actividad biológica de las fracciones resultantes será evaluada en función de la capacidad de inducir diferenciación en células en monocapa transfectadas con Oct4-GFP en función de la disminución de fluorescencia (evaluada por microscopia y citometria). Igualmente las fracciones serán ensayadas por incremento de fluorescencia en cuanto a su facultad de inducir diferenciación hacia linaje endodérmico con células transfectadas con los constructos AFP-GFP o INS-GFP, que incluyen la expresión de la proteína verde bajo control de promotores característicos del linaje endodérmico como alfa-fetoproteina o insulina. Las fracciones positivas serán sometidas a purificación ulterior y análisis mediante electroforesis bidimensional y espectroscopia de masas.