Influencia del microambiente tisular en la respuesta celular a la radiaciónimportancia del estado rédox

Resumen

TÍTULO: Influencia del microambiente tisular en la respuesta celular a la radiación: Importancia del estado redox INTRODUCCIÓN: El cáncer de mama es un problema principal de salud, la radioterapia es el tratamiento de elección mayoritario, estando extensamente aplicada en oncología. No todos los pacientes responden satisfactoriamente al tratamiento con radiación ionizante. Es por este motivo que son necesarios modos complementarios para mejorar la radioterapia tanto para aumentar la muerte de células del tumor como para disminuir el daño originado en los tejidos normales que circundan el tumor, que podrían convertirse en reservorio del cáncer. En este sentido, es relevante, considerando las diferencias genéticas y microambientales, determinar el papel que desempeñan los radicales libres presentes en tejidos normales y malignos en cada paciente de forma individual. Estos radicales libres están agrupados en especies reactivas del oxigeno y del nitrógeno (ROS/RNS) y la primera fuente de protección del cuerpo contra estos radicales libres, son los antioxidantes, compuestos que detienen el ataque y la formación de especies radicales dentro de la célula. El glutatión es un compuesto antioxidante que se encuentra en los estados reducido (GSH) y oxidado (disulfuro de glutatión, GSSG). En el estado reducido, secuestra ROS, transformándose en su forma oxidada, reciclándose mediante la actuación del enzima glutatión-reductasa (GRd). El GSH es un cofactor esencial para las enzimas antioxidantes llamadas GSH peroxidasas como glutatión peroxidasa (GPx), las cuales son utilizadas para desintoxicaciónde peróxidos, como por ejemplo el peróxido de hidrógeno. Por lo tanto, nuestro objetivo principal será estudiar si el estado del perfil redox, a lo largo del tiempo, va a condicionar la capacidad de respuesta frente al tratamiento con radiación ionizante. MATERIAL Y METODOS: Se han utilizado dos líneas celulares de cáncer de mama, MDA-MB-231 y MCF-7, que presentan diferente radiosensibilidad, siendo la línea celular MDA-MB-231 más radiorresistente que MCF-7 (datos previos obtenidos mediante ensayos clonogénicos). Las células fueron cultivadas en monocapa hasta que alcanzaron un 70-80% de confluencia. Posteriormente,se trataron con 100 µM de un inhibidor para GSH y GPX, butioninasulfóxido (BSO) y 150 mM de un inhibidor específico para GPx, 3-deoxiglucosano (3-DG), también se utilizaroniRNA (shRNA) para silenciar GPx1. Tras tratamiento con los diferentes inhibidores químicos y silenciamiento del gen GPx1, y después de recibir una dosis de 2 Gy de radiación ionizante, se cuantificaron los niveles de radicales libres y compuestos antioxidantes a diferentes tiempos: tiempos cortos (0 a 210 minutos) y tiempos largos (24 a 72 horas). En células tratadas y en controles se realizaron las siguientes determinaciones: 1) Medida de radicales libres (ROS) por citometría de flujo y (RNS) por espectrofotometría, 2) medida de antioxidantes naturales (niveles de Glutatión reducido ¿GSH¿ y oxidado ¿GSSG¿) por espectrofotometría y3) medida de enzimas antioxidantes (Glutatión Peroxidasa ¿GPx¿ y Glutatión Reductasa ¿GRd¿) por espectrofotometría. RESULTADOS: La línea celular MCF-7 presentó mayores niveles de RNS que la MDA-MB-231, tras recibir una dosis de 2 Gy de radiación a lo largo del tiempo.En cuanto a los niveles de ROS, MCF-7 mostró mayores porcentajes de expresión. En MCF-7, los valores de GSH, fueron menores que para MDA-MB-231. Los niveles de GSSG,fueron más altos en la línea celular MCF-7. Cuando pre-tratamos con BSO, tanto GSH como GSSG mostraron mayores niveles en MDA-MB-231.En el caso del inhibidor 3-DG, en GSSG no pudimos ver ninguna diferencia a lo largo del tiempo, en cambio para el caso de GSH, en los tiempos largos, MDA-MB-231 mostró niveles más elevados que MCF-7. Al silenciar GPx1 en MCF-7 (MCF-7 shGPx1), se observó un aumento de los niveles de GSH mientras que, para el caso de la línea celular MDA-MB-231 shGPX1,estos niveles disminuían respecto de los casos anteriores con los inhibidores BSO y 3-DG. El ratio GSH/GSH+GSSG, es menor en el caso de MCF-7 que en MDA-MB-231. Estos valores se invertían cuando pre-tratamos las células con BSO. El tratamiento con 3-DG en las líneas silenciadas, no pone de manifiesto ninguna diferencia a lo largo del tiempo.Los valores de la actividad enzimática GPx son mayores en MDA-MB-231 con respecto a MCF-7 en condiciones normales, en cambio, cuando tratamos con BSO y 3-DG, esta actividad se ve en mayor porcentaje disminuida en MDA-MB-231. Los estudios de supervivencia celular estimada mediante ensayos clonogénicos, reflejan mayor radiorresistencia de MCF-7 con respecto a MDA-MB-231después del tratamiento con BSO, en la dosis de 6 Gy.La misma tendencia se observó con el tratamiento con 3-DG. En cambio,el efecto del silenciamiento de GPx1 provocó un aumento de la radiosensibilidad en ambas líneas celulares. CONCLUSIONES: Los niveles de glutation reducido, GSH, están relacionados con la radiosensibilidad de las líneas celulares utilizadas en este trabajo. El uso de inhibidores químicos BSO y 3 DG confiere resistencia a la línea celular MCF-7, probablemente debida a los cambios originados en la progresión de las células a lo largo del ciclo celular tras irradiación. Sin embargo, la utilización de estos inhibidores provoca una radiosensibilización de las células MDA-MB-231. El silenciamiento del gen GPx1 confiere radiosensibilidad a ambas líneas celulares. La eficacia del tratamiento con radiación podría estar, en parte determinada, por la respuesta antioxidante encontrada en las líneas celulares de cáncer de mama estudiadas. BIBLIOGRAFÍA: Artacho-Cordón A, Artacho-Cordón F, Ríos-Arrabal S, Calvente I, Núñez MI (2012) Tumor microenvironment and breast cancer progression: A complex scenario. Cancer Biology & Therapy 13 (1):14-24 Brigelius-Flohé R, Kipp A (2009) Glutathione peroxidases in different stages of carcinogenesis. 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